Geautomatiseerd dissectieprotocol voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte
Summary
Digitale annotatie met geautomatiseerde weefseldissectie biedt een innovatieve benadering voor het verrijken van tumoren in gevallen met een laag tumorgehalte en kan worden aangepast aan zowel paraffine- als bevroren weefseltypen. De beschreven workflow verbetert de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en doorvoer en kan worden toegepast op zowel onderzoeks- als klinische omgevingen.
Abstract
Tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte, die lager zijn dan 20% tumorgehalte, afhankelijk van de methode, is vereist om kwaliteitsgegevens reproduceerbaar te genereren met veel downstream-testen zoals de volgende generatie sequencing. Geautomatiseerde weefseldissectie is een nieuwe methodologie die tumorverrijking in deze gemeenschappelijke weefsels met een laag tumorgehalte automatiseert en verbetert door de gebruikersafhankelijke onnauwkeurigheid van traditionele macrodissectie en tijd-, kosten- en expertisebeperkingen van laser capture microdissectie te verminderen door gebruik te maken van digitale beeldannotatie-overlay op niet-gekleurde dia’s. Hier worden digitale hematoxyline- en eosine (H &E) annotaties gebruikt om kleine tumorgebieden te targeten met behulp van een mes met een diameter van 250 μm2 in niet-gekleurd formaline vaste paraffine ingebed (FFPE) of vers bevroren secties tot 20 μm in dikte voor geautomatiseerde tumorverrijking voorafgaand aan nucleïnezuurextractie en whole exome sequencing (WES). Geautomatiseerde dissectie kan geannoteerde regio’s in weefsels met een laag tumorgehalte oogsten uit enkele of meerdere secties voor nucleïnezuurextractie. Het maakt het ook mogelijk om uitgebreide verzamelstatistieken voor en na de oogst vast te leggen, terwijl de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en het verhogen van de doorvoer worden verbeterd met minder dia’s. Het beschreven protocol maakt digitale annotatie mogelijk met geautomatiseerde dissectie op dierlijke en/of menselijke FFPE of vers ingevroren weefsels met een laag tumorgehalte en kan ook worden gebruikt voor elke regio van belang verrijking om de geschiktheid voor downstream sequencing-toepassingen in klinische of onderzoeksworkflows te vergroten.
Introduction
Next generation sequencing (NGS) wordt steeds vaker gebruikt voor zowel patiëntenzorg als in kankeronderzoek om behandelingen te begeleiden en wetenschappelijke ontdekkingen te vergemakkelijken. Weefsel is vaak beperkt en kleine monsters met een variabel tumorgehalte worden routinematig gebruikt. Tumortoereikendheid en integriteit blijven daarom een barrière voor het verkrijgen van zinvolle gegevens. Monsters met lagere tumorpercentages kunnen problemen veroorzaken bij het onderscheiden van echte varianten van sequencingartefacten en komen vaak niet in aanmerking voor NGS1. Tumorverrijking van gevallen met een laag tumorgehalte, die lager zijn dan 20%, heeft aangetoond dat het helpt voldoende materiaal te produceren om reproduceerbare sequencinggegevens te genereren en ervoor te zorgen dat laagfrequente varianten niet worden gemist 2,3. Limieten variëren echter afhankelijk van de gebruikte platforms en het geplande gebruik van de gegenereerde gegevens.
Traditioneel wordt verrijking van tumorgebieden voor extractie uitgevoerd door handmatige macrodissectie of laser capture microdissection (LCM) van formaline fixed paraffin embedded (FFPE) dia’s. Handmatige macrodissectie, of het schrapen van gespecificeerde weefselgebieden van dia’s, maakt het mogelijk om tumorgebieden te verwijderen voor gebruik in downstream-testen met relatief lage kosten, maar met lage nauwkeurigheid en lage precisie 2,4. Minimale technische nauwkeurigheid kan zeer effectief zijn bij gevallen met een hoger tumorgehalte waarbij grote tumorstroken aanwezig zijn en / of minimaal weefselverlies geen significante invloed heeft op de resultaten, maar gevallen met een laag tumorgehalte of gevallen met een meer verspreide tumor vereisen een verhoogde precisie. LCM werd daarom uitgevonden in de jaren 1990 en werd een waardevolle manier om kleine, gedefinieerde, microscopische weefselgebieden nauwkeurig te verwijderen uit formaline fixed paraffin embedded (FFPE) dia’s 5,6,7,8. LCM kan worden gebruikt om eencellige populaties te verzamelen wanneer er complexe heterogeniteit van de steekproef bestaat9 waardoor voorheen moeilijk te scheiden celpopulaties kunnen worden verzameld. LCM vereist echter dure machines die uitgebreide technische expertise en hands-on tijd 10,11,12,13,14 vereisen.
Het instrument dat wordt gebruikt voor geautomatiseerde weefseldissectie heeft een precisie tussen die van LCM (~ 10 μm) en macrodissecties (~ 1 mm)15. Bovendien vertoont het zowel kosten- als technische expertisevereisten tussen die van macrodissectie en LCM en is het ontworpen om snelle weefselverrijking uit te voeren van sequentiële FFPE-dia’s om de nadelen van eerdere methoden te verlichten15. Geautomatiseerde dissectie op deze manier maakt gebruik van digitale annotaties of referentieafbeeldingen op het podium dia-referentieafbeeldingen op serieel gesneden niet-gekleurde weefseldia’s voor het ontleden en verrijken van interessante gebieden. Het instrument maakt gebruik van kunststof spinmes freespunten, 1,5 ml verzamelbuizen en kan worden gebruikt met een aantal verschillende vloeistoffen voor dissectie om gebieden te verzamelen die van belang zijn voor downstream-assays, inclusief nucleïsche extractie en sequencing. De draaiende plastic freespunt maakt gebruik van binnen- en buitenspuitvatreservoirs en een zuiger om buffer te verzamelen, vervolgens molens en verzamelt weefsel16. De variabele diameter van de freespunt (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan dissectie van afzonderlijke weefselgebieden voor vergelijking mogelijk maken, multifocale gebieden die kunnen worden samengevoegd of individuele kleine gebieden van enkele of meerdere FFPE-dia’s. Sectiediktes die voor de oogst worden gebruikt, kunnen worden aangepast op basis van individuele experimentbehoeften en gebruikers kunnen ervoor zorgen dat interessante regio’s niet zijn uitgeput door een extra H &E uit te voeren op één seriële sectie onmiddellijk na de laatste sectie die voor de oogst is gebruikt.
Geautomatiseerde dissectie werd geïdentificeerd als een manier om het tumorgehalte te verrijken in gevallen met een laag tumorgehalte en we hebben de beoogde functionaliteit van een geautomatiseerd weefseldissectie-instrument getest en uitgebreid, dat momenteel op de markt wordt gebracht voor gebruik op klinische FFPE-monsters met een dikte tot 10 μm. Het werk toont aan dat geautomatiseerde dissectie kan worden toegepast op zowel FFPE als vers ingevroren menselijke of dierlijke weefselsecties tot 20 μm in dikte voor onderzoeksdoeleinden. Het protocol demonstreert ook een benadering voor het digitaal annoteren en automatiseren van dissectie voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte en / of gevallen met geneste, gedispergeerde tumor waar zinvolle macrodissectie een uitdaging of niet haalbaar is en toont zowel de kwaliteit als de opbrengst van nucleïnezuur voldoende voor NGS. Geautomatiseerde dissectie kan daarom middelmatige precisie en verhoogde doorvoer voor tumorverrijking bieden en kan ook worden toegepast om andere interessante regio’s te verrijken of te combineren met andere platforms om onderzoek of klinische vragen te beantwoorden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de toepassing van digitale annotatie en geautomatiseerde dissectie om tumorgebieden te ontleden van FFPE met een laag tumorgehalte of vers ingevroren weefsels voor tumorverrijking en gebruik in WES. Het combineren van digitale annotatie en maskercreatie met geautomatiseerde dissectie vermindert aanzienlijk de vereiste hands-on tijd en expertise die gebruikelijk zijn voor klassieke methoden van tumorverrijking, inclusief handmatige macrodissectie en LCM. Het protocol demonstreert…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen Carmina Espiritu en Robin E. Taylor bedanken voor hun steun bij de ontwikkeling van geautomatiseerde dissecties, evenals het personeel van het Genentech Pathology Core Laboratory dat dit werk heeft ondersteund.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center’s experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett’s Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
