Espectroscopía de eco de espín de neutrones como una sonda única para la dinámica de la membrana lipídica y las interacciones membrana-proteína

Summary

Este artículo describe los protocolos para la preparación de muestras, la reducción de datos y el análisis de datos en estudios de eco de espín de neutrones (NSE) de membranas lipídicas. El etiquetado juicioso de los lípidos con deuterio permite el acceso a diferentes dinámicas de membrana en escalas de longitud y tiempo mesoscópicas, sobre las cuales ocurren procesos biológicos vitales.

Abstract

Las bicapas lipídicas forman la matriz principal de las membranas celulares y son la plataforma principal para el intercambio de nutrientes, las interacciones proteína-membrana y la brotación viral, entre otros procesos celulares vitales. Para una actividad biológica eficiente, las membranas celulares deben ser lo suficientemente rígidas como para mantener la integridad de la célula y sus compartimentos, pero lo suficientemente fluidas como para permitir que los componentes de la membrana, como las proteínas y los dominios funcionales, se difundan e interactúen. Este delicado equilibrio de las propiedades de la membrana elástica y fluida, y su impacto en la función biológica, requieren una mejor comprensión de la dinámica colectiva de la membrana en escalas de tiempo y duración mesoscópicas de procesos biológicos clave, por ejemplo, deformaciones de membrana y eventos de unión a proteínas. Entre las técnicas que pueden sondear eficazmente este rango dinámico se encuentra la espectroscopia de eco de espín de neutrones (NSE). Combinado con el etiquetado de deuterio, NSE se puede utilizar para acceder directamente a las fluctuaciones de flexión y espesor, así como a la dinámica mesoscópica de características de membrana seleccionadas. Este documento proporciona una breve descripción de la técnica NSE y describe los procedimientos para realizar experimentos de NSE en membranas liposomales, incluidos los detalles de la preparación de muestras y los esquemas de deuteración, junto con instrucciones para la recopilación y reducción de datos. El documento también presenta métodos de análisis de datos utilizados para extraer parámetros clave de la membrana, como el módulo de rigidez de flexión, el módulo de compresibilidad del área y la viscosidad en el plano. Para ilustrar la importancia biológica de los estudios de NSE, se discuten ejemplos seleccionados de fenómenos de membrana sondeado por NSE, a saber, el efecto de los aditivos en la rigidez de flexión de la membrana, el impacto de la formación de dominios en las fluctuaciones de la membrana y la firma dinámica de las interacciones membrana-proteína.

Introduction

La comprensión de las membranas celulares y su función ha evolucionado notablemente en las últimas décadas. La visión anterior de las membranas celulares como bicapas lipídicas pasivas que definen los límites celulares y albergan proteínas de membrana¹ se ha transformado gradualmente en un modelo dinámico en el que las bicapas lipídicas desempeñan un papel importante en la regulación de los procesos biológicos vitales, incluida la señalización celular, el intercambio molecular y la función de las proteínas, por nombrar algunos^2,3,4,5,6. Esta comprensión de que las membranas celulares son altamente dinámicas, en constante remodelación y redistribución molecular, ha impulsado exploraciones científicas más allá de las estructuras de equilibrio de las membranas^7,8,9. En consecuencia, se han desarrollado múltiples enfoques para estudiar los diversos modos dinámicos en las membranas lipídicas biológicas y bioinspiradas. Hasta la fecha, la mayoría de estos estudios se han centrado principalmente en los movimientos moleculares difusivos^10,11,12,13 y las fluctuaciones macroscópicas de la forma^14,15,16,dejando un vacío significativo en la comprensión de la dinámica intermedia de la membrana, es decir, las fluctuaciones colectivas de los conjuntos de lípidos que consisten en unos pocos 10-100 de moléculas de lípidos. Estas dinámicas ocurren en escalas de longitud de pocas decenas a pocas 100 Å y en escalas de tiempo de sub-ns a unos pocos cientos de ns (ver Figura 1),referidas aquí como escalas mesoscópicas. De hecho, es en estas escalas que la actividad biológica clave tiene lugar a nivel de membrana¹⁷. Esto incluye la brotación viral^18,la canalización¹⁹y las interacciones membrana-proteína^20. También es importante señalar que el panorama energético de las proteínas de membrana^21,22 muestra que los cambios conformacionales en las proteínas, necesarios para su papel regulador, ocurren en las escalas de tiempo^{ns 23} de fluctuaciones colectivas de la membrana, enfatizando aún más la importancia de la dinámica mesoscópica en la función biológica de las membranas celulares y sus análogos bioinspirados²⁰. Este artículo se centra en los dos modos dinámicos mesoscópicos primarios en las membranas lipídicas, a saber, las fluctuaciones de flexión y las fluctuaciones de espesor.

El principal desafío al sondear directamente estos modos de fluctuación es la dificultad de acceder simultáneamente a sus escalas espaciales y temporales utilizando métodos de espectroscopia estándar. El otro desafío es que las técnicas de contacto directo podrían afectar las mismas fluctuaciones que se supone que miden¹⁶. Esto se ve agravado por la complejidad composicional y estructural de las membranas biológicas²⁴,^25,lo que resulta en características de membrana no homogéneas, incluida la formación de dominios lipídicos^{26,27,28,29,30} y la asimetría de membrana^31,32,33, que exigen sondas selectivas para comprender la dinámica de diferentes características de la membrana. Afortunadamente, estos desafíos pueden superarse con métodos de espectroscopia de neutrones no invasivos, como el eco de espín de neutrones (NSE), que inherentemente accede a las escalas de longitud y tiempo requeridas, y permiten además estudios de características selectivas de la membrana sin cambiar su entorno fisicoquímico³⁴. De hecho, en los últimos años la espectroscopia NSE se ha convertido en una sonda única y poderosa de dinámica colectiva de^{membranas 35}. Los resultados de los estudios de NSE sobre membranas lipídicas han producido nuevos conocimientos sobre las propiedades mecánicas^36,37 y viscoelásticas^38,39 de las membranas lipídicas y han arrojado nueva luz sobre su papel potencial en la función biológica^40,41.

La técnica de espectroscopia NSE se basa en un diseño de instrumento interferométrico, propuesto por primera vez por Mezei^42,utilizando una serie de aletas de espín y bobinas magnéticas para controlar la precesión del espín de neutrones a medida que los neutrones atraviesan el instrumento. El diseño se basa en el reflejo magnético de los elementos del campo magnético con respecto a la posición de la muestra (Figura 1A). Esto implica que en ausencia de intercambio de energía entre el neutrón y la muestra, el neutrón realiza el mismo número de precesiones de espín, en direcciones opuestas, en la primera y segunda mitad del instrumento (nótese el π-flipper entre las dos bobinas de precesión). Como resultado, el estado de espín final del neutrón permanece sin cambios en relación con el estado inicial, un fenómeno conocido como espín-eco (ver neutrón transparente en la Figura 1A). Sin embargo, cuando el neutrón interactúa energéticamente con la muestra, el intercambio de energía modifica el número de precesiones de espín en la segunda mitad del instrumento, lo que lleva a un estado de espín final diferente (ver Figura 1A). Esto se detecta experimentalmente como una pérdida en la polarización, como se mostrará más adelante en este artículo. Para obtener más detalles sobre la técnica NSE, se remite al lector a los documentos técnicos dedicados^42,43,44,45.

Aquí, se presenta una descripción simplificada para proporcionar una estimación aproximada de la longitud y las escalas de tiempo accesibles con NSE. Las escalas de longitud están determinadas por el rango de transferencias de vector de onda alcanzables, Q = 4π sin θ/λ, donde 2θ es el ángulo de dispersión y λ es la longitud de onda del neutrón. Se puede ver que Q está establecido por el rango de longitud de onda y la extensión de rotación del segundo brazo del espectrómetro (ver Figura 1A). Un rango Qtípico en los espectrómetros NSE es ~ 0.02-2 Å^-146,47y hasta 0.01-4 Å^-1 con actualizaciones recientes^48,49, correspondientes a escalas espaciales de ~ 1-600 Å. Por otro lado, la escala de tiempo accesible se calcula a partir del ángulo de precesión total (o fase) adquirido por el neutrón dentro de las bobinas de precesión magnética, y se encuentra que es^{de 50}: . En esta expresión, t es el tiempo de Fourier definido como , donde es la relación giromagnética de neutrones, es la longitud de la bobina y es la fuerza del campo magnético de la bobina. Vale la pena señalar que el tiempo de Fourier es una cantidad que depende estrictamente de la geometría del instrumento, la intensidad del campo magnético y la longitud de onda de los neutrones. Por ejemplo, utilizando neutrones de longitud de onda = 8 Å y ajustes del instrumento de   = 1,2 m y = 0,4 T, el tiempo de Fourier se calcula en t ~ 50 ns. Experimentalmente, el tiempo de Fourier se ajusta cambiando la corriente en las bobinas de precesión (es decir, la intensidad del campo magnético) o utilizando diferentes longitudes de onda de neutrones, lo que resulta en escalas de tiempo típicas de NSE de ~ 1 ps a 100 ns. Sin embargo, las actualizaciones recientes en los espectrómetros NSE han permitido el acceso a tiempos Fourier más largos, hasta ~ 400 ns en el espectrómetro J-NSE-Phoenix en el Heinz Maier-Leibnitz Zentrum⁵¹ y el espectrómetro SNS-NSE en el Laboratorio Nacional Oak Ridge^48,y hasta ~ 1,000 ns en el espectrómetro IN15 NSE en el Institut Laue-Langevin (ILL)⁴⁹. 

Además del acceso directo a la escala de tiempo y longitud de la dinámica de membranas, NSE tiene las capacidades inherentes de la sensibilidad a los isótopos de neutrones⁵². Específicamente, la capacidad de los neutrones para interactuar de manera diferente con los isótopos del hidrógeno, el elemento más abundante en los sistemas biológicos, da como resultado una densidad de longitud de dispersión de neutrones diferente,³⁴ o NSLD (el equivalente al índice óptico de refracción^50),cuando el protio es sustituido por deuterio. Esto permite un enfoque conocido como variación de contraste, que se usa comúnmente para resaltar características específicas de la membrana u ocultar otras; este último escenario se conoce como coincidencia de contraste. Una aplicación frecuente de variación/coincidencia de contraste es la sustitución de agua (NSLD = -0.56 × 10^-6 Å^-2) por agua pesada o D₂O (NSLD = 6.4 × 10^{-6 Å -2}) para amplificar la señal de neutrones de las membranas lipídicas protiatadas (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). Este enfoque es altamente efectivo en estudios de estructura de membrana porque la penetración de D₂O en la región del grupo de cabeza de la membrana permite la determinación precisa de los espesores de la membrana (ver Figura 2A,panel izquierdo) y de la ubicación de diferentes subgrupos lipídicos cuando se aplican modelos más sofisticados^53,54. Este artículo destaca algunos ejemplos sobre el uso de la variación de contraste para estudios de dinámica colectiva en membranas biomiméticas y características de membrana seleccionadas.

Aquí, la efectividad de NSE para proporcionar información única sobre las propiedades dinámicas y funcionales de la membrana se ilustra a través de ejemplos tangibles de estudios de NSE en sistemas de membrana lipídica modelo y biológicamente relevantes con énfasis en la dinámica de mesoescala en membranas independientes, en forma de suspensiones liposomales. Para las mediciones de NSE de la dinámica de la membrana en el plano, se remite al lector a publicaciones dedicadas a la espectroscopia de espín-eco de neutrones de incidencia de pastoreo (GINSES)^55,56 y otros estudios de pilas de membrana multilamelar alineadas^57,58,59,60.

Para simplificar, este artículo destaca tres esquemas diferentes de deuteración de membrana ilustrados en un sistema de bicapa lipídica de formación de dominios o separación de fases bien estudiado de mezclas de 1,2-ditiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) y 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC)^61,62. Los dos lípidos se caracterizan por un desajuste en la longitud de su cadena de hidrocarburos (14 carbonos/cola en DMPC vs 18 carbonos/cola en DSPC) y su temperatura de transición gel-fluido (T_{m, DMPC} = 23 °C vs T_{m, DSPC} = 55 °C). Esto da como resultado la separación de fases laterales en membranas DMPC:DSPC a temperaturas entre las temperaturas de transición superior e inferior de la mezcla⁶³. Los esquemas de deuteración considerados aquí se eligen para demostrar los diferentes modos dinámicos accesibles en las mediciones de NSE en membranas liposomales, a saber, fluctuaciones de flexión, fluctuaciones de espesor y fluctuaciones selectivas de flexión / espesor de dominios laterales. Todas las composiciones lipídicas se informan para las bicapas DMPC:DSPC preparadas a una fracción molar de 70:30, utilizando variantes protiated y perdeuteradas disponibles comercialmente de DMPC y DSPC. Todos los pasos de preparación de la muestra se basan en 4 mL de suspensión liposomal, en D₂O, con una concentración de lípidos de 50 mg/mL, para una masa lipídica total de M_tot = 200 mg por muestra.

Protocol

1. Esquema de deuteración requerido para el experimento Para las mediciones de fluctuación de flexión, realice liposomas completamente protiated en D2O (D 99.9%) o D2O-buffer (por ejemplo, tampón de fosfato preparado con D2O en lugar de H2O). Utilice DMPC (C36H72NO8P) y DSPC (C44H88NO8P) totalmente protiados con 133,4 mg, donde <em…

Representative Results

Los estudios de NSE que acceden a las fluctuaciones de flexión se realizan típicamente en un rango Q de ~ (0.04 – 0.2) Å-1. Este rango Q corresponde a escalas de longitud intermedia entre el grosor de la membrana y el radio liposomal, donde domina la dinámica de flexión. La medición en un rango Q extendido puede dar acceso a modos dinámicos adicionales, incluida la difusión liposomal y la dinámica intramembrana. Para obtener más detalles sobre el cruce en la dinámica de membranas a la que accede NSE…

Discussion

NSE es una técnica poderosa y única en la medición de la dinámica mesoscópica de las membranas lipídicas bajo diversas condiciones. La utilización efectiva de NSE depende de la calidad de la muestra, el contraste de neutrones y el rango de dinámica accesible que se puede sondear para una muestra determinada. Por lo tanto, se requieren varios pasos críticos para realizar experimentos exitosos de NSE y recopilar datos de alta calidad. Un paso clave para garantizar el uso efectivo del tiempo de haz de neutrones dur…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples