Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Summary

Dit artikel beschrijft de protocollen voor monstervoorbereiding, gegevensreductie en gegevensanalyse in neutronenspinecho (NSE) studies van lipidemembranen. Verstandige deuteriumetikettering van lipiden maakt toegang tot verschillende membraandynamiek op mesoscopische lengte- en tijdschalen mogelijk, waarover vitale biologische processen plaatsvinden.

Abstract

Lipide bilayers vormen de belangrijkste matrix van celmembranen en zijn het primaire platform voor nutriëntenuitwisseling, eiwit-membraan interacties, en virale ontluikende, onder andere vitale cellulaire processen. Voor een efficiënte biologische activiteit moeten celmembranen stijf genoeg zijn om de integriteit van de cel en zijn compartimenten te behouden, maar toch vloeibaar genoeg om membraancomponenten, zoals eiwitten en functionele domeinen, te laten diffuus en interactief te zijn. Deze delicate balans van elastische en vloeibare membraaneigenschappen, en hun impact op de biologische functie, vereist een beter begrip van de collectieve membraandynamiek over mesoscopische lengte- en tijdschalen van belangrijke biologische processen, zoals membraanvervormingen en eiwitbindende gebeurtenissen. Een van de technieken die dit dynamisch bereik effectief kan onderzoeken, is neutronenspinecho (NSE) spectroscopie. In combinatie met deuteriumetikettering kan NSE worden gebruikt om direct toegang te krijgen tot buig- en dikteschommelingen, evenals mesoscopische dynamiek van bepaalde membraankenmerken. Dit document geeft een korte beschrijving van de NSE-techniek en schetst de procedures voor het uitvoeren van NSE-experimenten op liposomale membranen, inclusief details van monstervoorbereidings- en deuteratieschema’s, samen met instructies voor het verzamelen en verminderen van gegevens. Het artikel introduceert ook gegevensanalysemethoden die worden gebruikt om belangrijke membraanparameters te extraheren, zoals de buigstijfheidsmodulus, gebiedsdrukmodulus en viscositeit in het vlak. Om het biologische belang van NSE-studies te illustreren, worden enkele voorbeelden van membraanverschijnselen besproken die door NSE zijn onderzocht, namelijk het effect van additieven op de stijfheid van membraanbuiging, de impact van domeinvorming op membraanschommelingen en de dynamische signatuur van membraan-eiwitinteracties.

Introduction

Het begrip van celmembranen en hun functie is de afgelopen decennia opmerkelijk geëvolueerd. De vroegere visie van celmembranen als passieve lipide-bilayers die celgrenzen definiëren en huismembraaneiwitten¹ is geleidelijk veranderd in een dynamisch model waarin lipide-tweelagen een belangrijke rol spelen bij het reguleren van vitale biologische processen, waaronder cellulaire signalering, moleculaire uitwisseling en eiwitfunctie – om er maar een paar^2,3,4,5,6te noemen . Dit besef dat celmembranen zeer dynamisch zijn en voortdurend een remodellering en moleculaire herverdeling ondergaan, heeft wetenschappelijke verkenningen aangedrongen die verder gaan dan evenwichtsstructuren van membranen^7,8,9. Dienovereenkomstig zijn meerdere benaderingen ontwikkeld om de verschillende dynamische modi in biologische en bio-geïnspireerde lipidenmembranen te bestuderen. Tot op heden hebben de meeste van deze studies zich voornamelijk gericht op diffusieve moleculaire bewegingen^10,11,12,13 en macroscopische vormschommelingen^14,15^,16, waardoor een aanzienlijke kloof is achtergelaten in het begrijpen van de intermediaire membraandynamiek, d.w.z. collectieve fluctuaties van lipidenassemblages bestaande uit enkele 10-100s lipidemoleculen. Deze dynamieken komen voor over lengteschalen van enkele tientallen tot enkele 100 Å en in de loop van de tijd schalen van sub-ns tot enkele honderden ns (zie figuur 1), hier aangeduid als mesoscopische schalen. Het is inderdaad op deze schalen dat belangrijke biologische activiteit plaatsvindt op membraanniveau¹⁷. Dit omvat virale ontluikende¹⁸, kanaal gating¹⁹, en membraan-eiwit interacties²⁰. Het is ook belangrijk erop te wijzen dat het energielandschap van membraaneiwitten^21,22 aantoont dat conformationele veranderingen in eiwitten — noodzakelijk voor hun regulerende rol — plaatsvinden in de tijdschalen²³ van collectieve membraanschommelingen , waarbij het belang van mesoscopische dynamiek in de biologische functie van celmembranen en hun bio-geïnspireerde analogen verder wordt benadrukt²⁰. Dit artikel richt zich op de twee primaire mesoscopische dynamische modi in lipidemembranen, namelijk buigschommelingen en dikteschommelingen.

De grootste uitdaging bij het direct onderzoeken van deze fluctuatiemodi is de moeilijkheid om tegelijkertijd toegang te krijgen tot hun ruimtelijke en temporele schalen met behulp van standaardspectroscopiemethoden. De andere uitdaging is dat directe contacttechnieken dezelfde fluctuaties kunnen beïnvloeden als die welke bedoeld zijn om¹⁶te meten . Dit wordt nog verergerd door de compositorische en structurele complexiteit van biologische membranen^24,25, wat resulteert in niet-homogene membraankenmerken, waaronder lipidedomeinvorming^{26,27,28,29,30} en membraanasymmetrie^31,32,33– die selectieve sondes vereisen om de dynamiek van verschillende membraankenmerken te begrijpen. Gelukkig kunnen deze uitdagingen worden overwonnen met niet-invasieve neutronenspectroscopiemethoden, zoals neutronenspinecho (NSE), die inherent toegang hebben tot de vereiste lengte- en tijdschalen, en verder studies van selectieve membraankenmerken mogelijk maken zonder hun fysisch-chemische omgeving te veranderen³⁴. Inderdaad, in de afgelopen jaren is NSE spectroscopie geëvolueerd tot een unieke en krachtige sonde van collectieve membraandynamica³⁵. Resultaten van NSE-studies over lipidemembranen hebben nieuwe inzichten opgeleverd in mechanische^36,37 en visco-elastische^38,39 eigenschappen van lipidemembranen en hebben nieuw licht geworpen op hun potentiële rol in biologische functie^40,41.

De NSE-spectroscopietechniek is gebaseerd op een interferometrisch instrumentontwerp, voor het eerst voorgesteld door Mezei⁴², met behulp van een reeks spin-flippers en magnetische spoelen om de precessie van de neutronenspin te regelen terwijl neutronen het instrument doorkruisen. Het ontwerp berust op magnetische spiegeling van de magnetische veldelementen ten opzichte van de monsterpositie (figuur 1A). Dit houdt in dat bij gebrek aan energie-uitwisseling tussen het neutron en het monster, het neutron hetzelfde aantal spinprecessies uitvoert, in tegengestelde richting, in de eerste en tweede helft van het instrument (let op de π-flipper tussen de twee precessiespoelen). Als gevolg hiervan blijft de uiteindelijke spintoestand van het neutron ongewijzigd ten opzichte van de begintoestand – een fenomeen dat spin-echo wordt genoemd (zie transparant neutron in figuur 1A). Wanneer het neutron echter energetisch interageert met het monster, wijzigt de energie-uitwisseling het aantal spinprecessies in de tweede helft van het instrument, wat leidt tot een andere eindspintoestand (zie figuur 1A). Dit wordt experimenteel gedetecteerd als een verlies in polarisatie, zoals later in dit artikel zal worden getoond. Voor meer informatie over de NSE-techniek wordt de lezer verwezen naar speciale technische documenten^42,43,44,45.

Hier wordt een vereenvoudigde beschrijving gepresenteerd om een ruwe schatting te geven van de lengte- en tijdschalen die toegankelijk zijn met NSE. De lengteschalen worden bepaald door het bereik van haalbare wavevectortransfers, Q = 4π sin θ/λ, waarbij 2θ de verstrooiingshoek is en λ de neutronengolflengte. Men kan zien dat Q wordt ingesteld door het golflengtebereik en de mate van rotatie van de tweede arm van de spectrometer (zie figuur 1A). Een typisch Q-bereikop NSE-spectrometers is ~0.02-2 Å^-146,47en tot 0.01-4 Å^-1 met recente upgrades^48,49, overeenkomend met ruimtelijke schalen van ~1-600 Å. Aan de andere kant wordt de toegankelijke tijdschaal berekend op basis van de totale precessiehoek (of fase) die het neutron in de magnetische precessiespoelen heeft verkregen, en blijkt^{deze 50}te zijn : . In deze uitdrukking is t de Fouriertijd gedefinieerd als , waar is de neutronen gyromagnetische verhouding, is de spoellengte, en is de sterkte van het magnetisch veld van de spoel. Het is de moeite waard erop te wijzen dat de Fouriertijd een hoeveelheid is die strikt afhankelijk is van de instrumentgeometrie, de magnetische veldsterkte en de neutronengolflengte. Bijvoorbeeld, met behulp van neutronen van golflengte = 8 Å en instrumentinstellingen van   = 1,2 m en = 0,4 T, wordt de Fouriertijd berekend op t ~ 50 ns. Experimenteel wordt de Fouriertijd afgestemd door de stroom in de precessiespoelen (d.w.z. magnetische veldsterkte) te veranderen of verschillende neutronengolflengten te gebruiken, wat resulteert in typische NSE-tijdschalen van ~ 1 ps tot 100 ns. Recente upgrades in NSE-spectrometers hebben echter toegang gegeven tot langere Fourier-tijden, tot ~ 400 ns op de J-NSE-Phoenix spectrometer op de Heinz Maier-Leibnitz Zentrum⁵¹ en de SNS-NSE spectrometer in Oak Ridge National Lab⁴⁸, en tot ~ 1.000 ns op de IN15 NSE spectrometer in het Institut Laue-Langevin (ILL). 

Naast directe toegang tot de lengte- en tijdschaal van membraandynamica heeft NSE de inherente mogelijkheden van neutronenisotopengevoeligheid⁵². Met name het vermogen van neutronen om verschillend te interageren met de isotopen van waterstof, het meest voorkomende element in biologische systemen, resulteert in een andere neutronenverstrooiingslengtedichtheid,³⁴ of NSLD (het equivalent van de optische brekingsindex⁵⁰), wanneer protium wordt vervangen door deuterium. Dit maakt een benadering mogelijk die bekend staat als contrastvariatie, die vaak wordt gebruikt om specifieke membraankenmerken te benadrukken of anderen te verbergen – het laatste scenario wordt contrastmatching genoemd. Een frequente toepassing van contrastvariatie/matching is de vervanging van water (NSLD = -0,56 × 10^-6 Å^-2) door zwaar water of D₂O (NSLD = 6,4 × 10^-6 Å^-2) om het neutronensignaal van geprotieerde lipidemembranen (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2)te versterken. Deze aanpak is zeer effectief in studies van membraanstructuur omdat de penetratie van D₂O in het hoofdgroepgebied van het membraan een nauwkeurige bepaling van de membraandikten mogelijk maakt (zie figuur 2A, linkerpaneel) en van de locatie van verschillende lipidesubgroepen wanneer meer geavanceerde modellen worden toegepast^53,54. Dit artikel belicht enkele voorbeelden over het gebruik van contrastvariatie voor studies naar collectieve dynamiek in biomimetische membranen en bepaalde membraankenmerken.

Hier wordt de effectiviteit van NSE bij het bieden van unieke inzichten in dynamische en functionele membraaneigenschappen geïllustreerd aan de hand van tastbare voorbeelden van NSE-studies naar model- en biologisch relevante lipidenmembraansystemen met de nadruk op mesoschaaldynamiek in vrijstaande membranen, in de vorm van liposomale suspensuspensuspensussen. Voor NSE-metingen van membraandynamica in het vlak wordt de lezer verwezen naar speciale publicaties over beweidingsincidentie neutronenspin-echospectroscopie (GINSES)^55,56 en andere studies van uitgelijnde multilamellar membraanstapels^57,58,59,60.

Voor de eenvoud belicht dit artikel drie verschillende schema’s van membraandeuteratie geïllustreerd op een goed bestudeerd domeinvormend, of fasescheidend, lipidenbilayer-systeem van 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) en 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC) mengsels^61,62. De twee lipiden worden gekenmerkt door een mismatch in hun koolwaterstofketenlengte (14 carbons/tail in DMPC vs 18 carbons/tail in DSPC) en hun gel-fluid overgangstemperatuur (T_{m, DMPC} = 23 °C vs T_{m, DSPC} = 55 °C). Dit resulteert in laterale fasescheiding in DMPC:DSPC-membranen bij temperaturen tussen de bovenste en onderste overgangstemperaturen van het mengsel⁶³. De hier overwogen deuteratieschema’s zijn gekozen om de verschillende dynamische modi aan te tonen die toegankelijk zijn in NSE-metingen op liposomale membranen, namelijk buigschommelingen, dikteschommelingen en selectieve buig-/dikteschommelingen van laterale domeinen. Alle lipidesamenstellingen worden gerapporteerd voor DMPC:DSPC-bilayers bereid met een molfractie van 70:30, met behulp van in de handel verkrijgbare protiated en perdeuterated varianten van DMPC en DSPC. Alle monstervoorbereidingsstappen zijn gebaseerd op 4 ml liposomale suspensie, in D₂O, met een lipideconcentratie van 50 mg/ml, voor een totale lipidenmassa van M_tot = 200 mg per monster.

Protocol

1. Deuteratieschema vereist voor het experiment Voor buigfluctuatiemetingen, maak volledig geprotieerde liposomen in D2O (D 99,9%) of D2O-buffer (bijv. fosfaatbuffer bereid met D2O in plaats van H2O). Gebruik volledig geprotiteerd DMPC (C36H72NO8P) en DSPC (C44H88NO8P) met 133,4 mg, waarbij XDMPC en XD…

Representative Results

NSE-studies die toegang krijgen tot buigschommelingen worden meestal uitgevoerd over een Q-bereik van ~ (0,04 – 0,2) Å-1. Dit Q-bereik komt overeen met tussenliggende lengteschalen tussen de membraandikte en de liposomale radius, waar buigdynamiek domineert. Meting over een uitgebreid Q-bereik kan toegang geven tot extra dynamische modi, waaronder liposomale diffusie en intramembrane dynamica. Voor meer informatie over de cross-over in membraandynamiek die NSE heeft geraadpleegd , raadpleegt u deze relevante …

Discussion

NSE is een krachtige en unieke techniek in het meten van mesoscopische dynamiek van lipidenmembranen onder verschillende omstandigheden. Het effectieve gebruik van NSE hangt af van de monsterkwaliteit, het neutronencontrast en het bereik van de toegankelijke dynamiek die voor een bepaald monster kan worden onderzocht. Er zijn dus verschillende kritieke stappen nodig voor het uitvoeren van succesvolle NSE-experimenten en het verzamelen van hoogwaardige gegevens. Een belangrijke stap in het waarborgen van het effectieve ge…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples