النيوترون تدور صدى الطيف كمسبار فريد لديناميات الغشاء الدهني والتفاعلات الغشاء البروتين

Summary

تصف هذه الورقة بروتوكولات إعداد العينات، والحد من البيانات، وتحليل البيانات في دراسات صدى الدوران النيوتروني (NSE) للأغشية الدهنية. تمكن وسمة الديوتريوم الحكيمة للدهون من الوصول إلى ديناميكيات غشاء مختلفة على الطول والمقاييس الزمنية بالمنظار ، والتي تحدث عليها العمليات البيولوجية الحيوية.

Abstract

تشكل الطبقات ثنائية الدهون المصفوفة الرئيسية لأغشية الخلايا وهي المنصة الأساسية لتبادل العناصر الغذائية ، والتفاعلات بين البروتين والغشاء ، والفيروسية الناشئة ، من بين عمليات خلوية حيوية أخرى. للنشاط البيولوجي الفعال، يجب أن تكون أغشية الخلايا جامدة بما يكفي للحفاظ على سلامة الخلية ومقصوراتها ولكنها سائلة بما يكفي للسماح لمكونات الأغشية، مثل البروتينات والمجالات الوظيفية، بالانتشراط والتفاعل. هذا التوازن الدقيق لخصائص الأغشية المرنة والسائلة ، وتأثيرها على الوظيفة البيولوجية ، يتطلب فهما أفضل لديناميكيات الأغشية الجماعية على طول الغشاء التنظيري والمقاييس الزمنية للعمليات البيولوجية الرئيسية ، على سبيل المثال ، تشوهات الأغشية وأحداث ربط البروتين. من بين التقنيات التي يمكن أن تحقق بشكل فعال هذا النطاق الديناميكي هو النيوترون صدى دوران (NSE) الطيفية. جنبا إلى جنب مع وضع العلامات الديوتريوم، يمكن استخدام NSE للوصول مباشرة الانحناء وتقلبات سمك، فضلا عن ديناميات التنظير من ميزات غشاء مختارة. تقدم هذه الورقة وصفا موجزا لتقنية NSE وتحدد إجراءات إجراء تجارب NSE على الأغشية الدهنية ، بما في ذلك تفاصيل إعداد العينات ومخططات الديوتر ، إلى جانب تعليمات لجمع البيانات والحد منها. كما تقدم الورقة أساليب تحليل البيانات المستخدمة لاستخراج معلمات الغشاء الرئيسية، مثل معامل صلابة الانحناء، ومعامل ضغط المنطقة، واللزوجة داخل الطائرة. لتوضيح الأهمية البيولوجية لدراسات NSE ، تتم مناقشة أمثلة مختارة من الظواهر الغشائية التي بحثتها NSE ، وهي تأثير الإضافات على صلابة الانحناء الغشائي ، وتأثير تكوين المجال على تقلبات الأغشية ، والتوقيع الديناميكي للتفاعلات بين الغشاء والبروتين.

Introduction

تطور فهم أغشية الخلايا ووظيفتها بشكل ملحوظ على مدى العقود القليلة الماضية. وقد تحولت النظرة السابقة لأغشية الخلايا كثنائيات الدهون السلبية التي تحدد حدود الخلايا وبروتينات غشاء المنزل¹ تدريجيا إلى نموذج ديناميكي تلعب فيه الطبقات ثنائية الدهون دورا مهما في تنظيم العمليات البيولوجية الحيوية ، بما في ذلك الإشارات الخلوية والتبادل الجزيئي ووظيفة البروتين – على سبيل المثاللا الحصر^2و3و^4و5و⁶. هذا الإدراك بأن أغشية الخلايا ديناميكية للغاية ، وتخضع باستمرار لإعادة العرض وإعادة التوزيع الجزيئي ، وقد حث الاستكشافات العلمية وراء هياكل التوازن للأغشية^7و8و9. وبناء على ذلك، تم تطوير نهج متعددة لدراسة مختلف الأنماط الديناميكية في الأغشية الدهنية البيولوجية والحيوى. حتى الآن، ركزت غالبية هذه الدراسات في المقام الأول على نشر الحركات الجزيئية^{10،11،12،13} وتقلبات الشكل العياني^14،15،16، مما يترك فجوة كبيرة في فهم ديناميات الأغشية المتوسطة ، أي التقلبات الجماعية لجمعيات الدهون التي تتكون من عدد قليل من 10-100s من جزيئات الدهون. تحدث هذه الديناميكيات على مقاييس طول من عشرات قليلة إلى عدد قليل من 100 Å وعلى مدى المقاييس الزمنية من ns الفرعية إلى بضع مئات من ns (انظر الشكل 1)، ويشار إليها هنا باسم جداول التنظير. هو حقا على هذا ميزان أن نشاط رئيسية أحيائية يتم في الغشاء مستوى¹⁷. وهذا يشمل الفيروسية الناشئة¹⁸، قناة gating¹⁹، والتفاعلات الغشاء البروتين²⁰. من المهم أيضا الإشارة إلى أن مشهد الطاقة للبروتينات الغشائية^21،22 يظهر أن التغيرات التوافقية في البروتينات – الضرورية لدورها التنظيمي – تحدث على مدى المقاييس الزمنية²³ من تقلبات الأغشية الجماعية ، مما يؤكد كذلك على أهمية الديناميكيات التنظيرية في الوظيفة البيولوجية لأغشية الخلايا ونظائرها ذات الأغشية الحيوية^20. تركز هذه الورقة على الوضعين الديناميكيين الأساسيين بالمنظار في الأغشية الدهنية ، وهما تقلبات الانحناء وتقلبات السماكة.

ويتمثل التحدي الرئيسي في التحقيق المباشر في أوضاع التقلبات هذه في صعوبة الوصول في الوقت نفسه إلى مقاييسها المكانية والزمنية باستخدام أساليب التحليل الطيفي القياسية. والتحدي الآخر هو أن تقنيات الاتصال المباشر يمكن أن تؤثر على نفس التقلبات التي يقصد بها قياس^16. ومما يزيد من تفاقم هذا التعقيد التركيبي والهيكلي للأغشية البيولوجية^24،25، مما يؤدي إلى ميزات غشاء غير متجانسة ، بما في ذلك تشكيل المجال الدهني^{26،27،28،29،30} وعدم تناسق الأغشية^31،32،33– مما يتطلب تحقيقات انتقائية لفهم ديناميات ميزات الأغشية المختلفة. لحسن الحظ ، يمكن التغلب على هذه التحديات باستخدام طرق التحليل الطيفي النيوتروني غير الغازية ، مثل صدى الدوران النيوتروني (NSE) ، والتي تدخل بطبيعتها إلى الطول والمقاييس الزمنية المطلوبة ، وتمكن من إجراء دراسات حول ميزات الغشاء الانتقائي دون تغيير بيئتها الفيزيائية^{الكيميائية 34.} في الواقع ، على مدى السنوات القليلة الماضية تطور التحليل الطيفي NSE إلى مسبار فريد وقوي من ديناميكيات الغشاء الجماعي^35. وقد أنتجت نتائج دراسات NSE على الأغشية الدهنية رؤى جديدة في^{الميكانيكية 36،37} وviscoelastic^38،39 خصائص الأغشية الدهنية وألقت ضوءا جديدا على دورها المحتمل في الوظيفة البيولوجية^40،41.

تعتمد تقنية التحليل الطيفي NSE على تصميم أداة التداخل ، الذي اقترحه Mezei⁴²لأول مرة ، باستخدام سلسلة من الزعانف الدوارة واللفائف المغناطيسية للتحكم في مقدمة الدوران النيوتروني أثناء اجتياز النيوترونات للجهاز. يعتمد التصميم على النسخ المتطابق المغناطيسي لعناصر المجال المغناطيسي فيما يتعلق بموضع العينة(الشكل 1A). وهذا يعني أنه في غياب تبادل الطاقة بين النيوترون والعينة ، يؤدي النيوترون نفس العدد من السبق الدوراني ، في اتجاهين متعاكسين ، في النصف الأول والثاني من الجهاز (لاحظ π الزعانف بين لفائف السبق). ونتيجة لذلك، تبقى حالة الدوران النهائية للنيوترون دون تغيير بالنسبة للدولة الأولية – وهي ظاهرة يشار إليها باسم الدوران صدى (انظر النيوترون الشفاف في الشكل 1A). ومع ذلك ، عندما يتفاعل النيوترون بنشاط مع العينة ، يعدل تبادل الطاقة عدد السبقات الدورانية في النصف الثاني من الجهاز ، مما يؤدي إلى حالة دوران نهائية مختلفة (انظر الشكل 1A). يتم الكشف عن هذا تجريبيا كخسارة في الاستقطاب ، كما سيظهر لاحقا في هذه الورقة. لمزيد من التفاصيل حول تقنية NSE ، يشار إلى القارئ إلى الأوراق الفنية^{المخصصة 42،43،44،45}.

هنا، يتم تقديم وصف مبسط لتقديم تقدير تقريبي للطول والجداول الزمنية التي يمكن الوصول إليها مع NSE. يتم تحديد موازين الطول من خلال نطاق عمليات نقل الموجات القابلة للتحقيق، Q = 4π sin ο/λ، حيث 2ο هي زاوية التشتت و λ هو الطول الموجي النيوتروني. يمكن للمرء أن يرى أن يتم تعيين Q من قبل نطاق الطول الموجي ومدى دوران الذراع الثاني للمطياف (انظر الشكل 1A). نموذجي Q-rangeعلى مطياف NSE هو ~0.02-2 Å^-146,47, وحتى 0.01-4 Å^-1 مع الترقيات الأخيرة^48,49, المقابلة لمقاييس المكانية من ~ 1-600 Å. من ناحية أخرى، يتم حساب مقياس الوقت الذي يمكن الوصول إليه من زاوية السبق الكلية (أو المرحلة) التي يكتسبها النيوترون داخل لفائف السبق المغناطيسي، ووجد أن⁵⁰: . في هذا التعبير، t هو الوقت فورييه تعريفها بأنها ، حيث هي نسبة الدوران النيوتروني، هو طول لفائف، وقوة المجال المغناطيسي لللفائف. تجدر الإشارة إلى أن وقت فورييه هو كمية تعتمد بشكل صارم على هندسة الجهاز ، وقوة المجال المغناطيسي ، والطول الموجي النيوتروني. على سبيل المثال، باستخدام نيوترونات الطول الموجي = 8 Å وإعدادات الصك   = 1.2 متر و = 0.4 T، يتم حساب وقت فورييه ليكون t ~ 50 ns. تجريبيا، يتم ضبطها الوقت فورييه عن طريق تغيير التيار في لفائف قبل الخراج (أي قوة المجال المغناطيسي) أو باستخدام أطوال موجية نيوترونية مختلفة، مما أدى إلى جداول زمنية NSE نموذجية من ~ 1 PS إلى 100 ns. ومع ذلك، مكنت الترقيات الأخيرة في مطياف NSE الوصول إلى أوقات فورييه أطول، ما يصل إلى ~ 400 ns على مطياف J-NSE-Phoenix في هاينز ماير-ليبنيتز Zentrum⁵¹ ومطياف SNS-NSE في مختبر أوك ريدج الوطني⁴⁸، وما يصل إلى ~ 1000 ns في مطياف NSE IN15 في معهد لو لانجفين (ILL)⁴⁹. 

وإلى جانب الوصول المباشر إلى طول ديناميات الأغشية ونطاقها الزمني، فإن NSE لديها القدرات الكامنة في حساسية النظائر النيوترونية^52. وعلى وجه التحديد، فإن قدرة النيوترونات على التفاعل بشكل مختلف مع نظائر الهيدروجين، وهو العنصر الأكثر وفرة في النظم البيولوجية، تؤدي إلى كثافة مختلفة لطول النيوترونات المتناثرة،³⁴ أو NSLD (أي ما يعادل المؤشر البصري للانكسار^50)،عندما يتم استبدال البروتيوم بالديوتريوم. وهذا يمكن من اتباع نهج يعرف باسم التباين التبايني، والذي يستخدم عادة لتسليط الضوء على ميزات غشاء محددة أو إخفاء الآخرين – ويشار إلى السيناريو الأخير على أنه مطابقة التباين. التطبيق المتكرر للتباين / المطابقة هو استبدال الماء (NSLD = -0.56 × 10^-6 Å^-2)بالماء الثقيل أو D₂O (NSLD = 6 .4 × 10-6 Å^-2)لتضخيم إشارة النيوترون من الأغشية الدهنية البروتية (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). هذا النهج فعال للغاية في دراسات بنية الغشاء لأن اختراق D₂O في منطقة مجموعة الرأس من الغشاء يسمح بتحديد دقيق لسماكة الغشاء (انظر الشكل 2A، اللوحة اليسرى) وموقع المجموعات الفرعية المختلفة للدهون عندما يتم تطبيق نماذج أكثر تطورا^53،54. تسلط هذه الورقة الضوء على بعض الأمثلة على استخدام التباين في دراسات الديناميكيات الجماعية في الأغشية المحاكاة الحيوية وميزات الأغشية المختارة.

هنا ، تتجلى فعالية NSE في توفير رؤى فريدة في خصائص الأغشية الديناميكية والوظيفية من خلال أمثلة ملموسة لدراسات NSE على أنظمة أغشية الدهون النموذجية والوثيقة الصلة بيولوجيا مع التركيز على ديناميكيات مقياس المتوسط في الأغشية القائمة بذاتها ، في شكل تعليق ليبوسومي. بالنسبة لقياسات NSE لديناميكيات الأغشية داخل الطائرة ، يشار إلى القارئ إلى منشورات مخصصة حول التحليل الطيفي للنيوترونات الدورانية الصدى (GINSES)^55و56 ودراسات أخرى لمداخن الأغشية متعددة اللاميلار المنحازة^57و58و59و⁶⁰.

للبساطة ، تسلط هذه الورقة الضوء على ثلاثة مخططات مختلفة من الديوتريشن الغشاء يتضح على تشكيل المجال مدروسة جيدا ، أو فصل المرحلة، نظام ثنائي الطبقات الدهون من 1،2-dimyristoyl-sn-glycero-3-فوسفوتشولين (DMPC) و 1،2-distearoyl-sn-glycero-3-فوسفوتشولين (DSPC) خلائط^61،62. وتتميز الدهون اثنين من عدم تطابق في طول سلسلة الهيدروكربونات (14 الكربونات / الذيل في DMPC مقابل 18 الكربون / الذيل في DSPC) ودرجة الحرارة انتقال هلام السائل (T_{M، DMPC} = 23 درجة مئوية مقابل T_{م، DSPC} = 55 درجة مئوية). وهذا يؤدي إلى فصل المرحلة الجانبية في DMPC: DSPC الأغشية في درجات الحرارة بين درجات الحرارة الانتقالية العليا والسفلى من الخليط⁶³. يتم اختيار مخططات الديوتر التي تم النظر فيها هنا لإظهار الأنماط الديناميكية المختلفة التي يمكن الوصول إليها في قياسات NSE على الأغشية الدهنية ، وهي تقلبات الانحناء ، وتقلبات السماكة ، وتقلبات الانحناء / السماكة الانتقائية للمجالات الجانبية. يتم الإبلاغ عن جميع التراكيب الدهنية لDMPC: DSPC الطبقات الثنائية المعدة في جزء الخلد من 70:30، وذلك باستخدام المتغيرات المتاحة تجاريا بروتيات و perdeuterated من DMPC وDSPC. وتستند جميع خطوات إعداد العينة على 4 مل من تعليق الدهون، في D₂O، مع تركيز الدهون من 50 ملغم / مل، لكتلة الدهون الإجمالية من_توت M= 200 ملغ لكل عينة.

Protocol

1. مخطط الديوتريشن المطلوب للتجربة لقياسات تقلبات الانحناء، قم بإجراء ليبوسومات بروتيات بالكامل في D2O (D 99.9٪) أو D2O-buffer (على سبيل المثال، مخزن الفوسفات المؤقت المعد مع D2O بدلا من H2O). استخدام DMPC بروتيات بالكامل (C36H72NO8P) و DSPC (C44H88NO8P…

Representative Results

عادة ما يتم إجراء دراسات NSE الوصول إلى تقلبات الانحناء على مدى Q من ~ (0.04 – 0.2) Å-1. يتوافق نطاق Q هذا مع مقاييس الطول المتوسطة بين سمك الغشاء ونصف قطر الليبوزوما، حيث تهيمن ديناميكيات الانحناء. يمكن أن يمنح القياس عبر نطاق Q الموسع إمكانية الوصول إلى أوضاع ديناميكية إضافية، بما في ذلك الان…

Discussion

NSE هي تقنية قوية وفريدة من نوعها في قياس الديناميات التنظيرية للأغشية الدهنية في ظل ظروف مختلفة. يعتمد الاستخدام الفعال ل NSE على جودة العينة والتباين النيوتروني ونطاق الديناميكيات التي يمكن الوصول إليها والتي يمكن بحثها لعينة معينة. وبالتالي، هناك العديد من الخطوات الحاسمة المطلوبة لإجر?…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples