Cet article décrit les protocoles de préparation des échantillons, de réduction des données et d’analyse des données dans les études d’écho de spin neutronique (NSE) des membranes lipidiques. Le étiquetage judicieux des lipides au deutérium permet d’accéder à différentes dynamiques membranaires sur des échelles de longueur et de temps mésoscopiques, sur lesquelles se produisent des processus biologiques vitaux.
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Article de méthode
Spectroscopie d’écho de spin neutronique en tant que sonde unique pour la dynamique de la membrane lipidique et les interactions membrane-protéine
Dans cet article
Avis d’erratum
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Résumé
Résumé
Les bicouches lipidiques forment la matrice principale des membranes cellulaires et constituent la principale plate-forme pour l’échange de nutriments, les interactions protéine-membrane et le bourgeonnement viral, entre autres processus cellulaires vitaux. Pour une activité biologique efficace, les membranes cellulaires doivent être suffisamment rigides pour maintenir l’intégrité de la cellule et de ses compartiments, mais suffisamment fluides pour permettre aux composants membranaires, tels que les protéines et les domaines fonctionnels, de diffuser et d’interagir. Cet équilibre délicat des propriétés des membranes élastiques et fluides, et leur impact sur la fonction biologique, nécessitent une meilleure compréhension de la dynamique collective des membranes sur les échelles de longueur et de temps mésoscopiques des processus biologiques clés, par exemple les déformations membranaires et les événements de liaison aux protéines. Parmi les techniques qui peuvent sonder efficacement cette plage dynamique, il y a la spectroscopie par écho de spin neutronique (NSE). Combiné au labelage au deutérium, le NSE peut être utilisé pour accéder directement aux fluctuations de flexion et d’épaisseur ainsi qu’à la dynamique mésoscopique de certaines caractéristiques de la membrane. Cet article fournit une brève description de la technique NSE et décrit les procédures pour effectuer des expériences NSE sur les membranes liposomales, y compris des détails sur les schémas de préparation et de deutération des échantillons, ainsi que des instructions pour la collecte et la réduction des données. L’article présente également des méthodes d’analyse de données utilisées pour extraire des paramètres clés de la membrane, tels que le module de rigidité de flexion, le module de compressibilité de surface et la viscosité dans le plan. Pour illustrer l’importance biologique des études NSE, certains exemples de phénomènes membranaires sondés par NSE sont discutés, à savoir l’effet des additifs sur la rigidité de flexion de la membrane, l’impact de la formation de domaine sur les fluctuations membranaires et la signature dynamique des interactions membrane-protéine.
Introduction
La compréhension des membranes cellulaires et de leur fonction a remarquablement évolué au cours des dernières décennies. L’ancienne vision des membranes cellulaires en tant que bicouches lipidiques passives qui définissent les limites cellulaires et abritent les protéines membranaires1 s’est progressivement transformée en un modèle dynamique dans lequel les bicouches lipidiques jouent un rôle important dans la régulation des processus biologiques vitaux, y compris la signalisation cellulaire, l’échange moléculaire et la fonction protéique – pour n’en nommer que quelques-uns2,3....
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Protocole
1. Schéma de deutération requis pour l’expérience
- Pour les mesures de fluctuation de flexion, faire des liposomes entièrement protiés dans D2O (D 99,9%) ou D2O-tampon (par exemple, tampon phosphate préparé avec D2O au lieu de H2O). Utilisez du DMPC entièrement protié (C36H72NO8P) et du DSPC (C44H88NO8P) avec
133,4 mg, où XDMPC et XDSPC sont les fractions molaires de DMPC et DSPC, ici réglés à 0,7 et 0,3, respec....
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Résultats
Les études NSE accédant aux fluctuations de flexion sont généralement réalisées sur une plage Q de ~ (0,04 - 0,2) Å-1. Cette gamme Q correspond à des échelles de longueur intermédiaires entre l’épaisseur de la membrane et le rayon liposomal, où la dynamique de flexion domine. La mesure sur une plage Q étendue peut donner accès à des modes dynamiques supplémentaires, y compris la diffusion liposomale et la dynamique intramembranaire. Pour plus de détails sur le cross-over dans la dynamique membranaire accessibl.......
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Discussion
NSE est une technique puissante et unique dans la mesure de la dynamique mésoscopique des membranes lipidiques dans diverses conditions. L’utilisation efficace de la NSE dépend de la qualité de l’échantillon, du contraste des neutrons et de la gamme de dynamiques accessibles qui peuvent être sondées pour un échantillon donné. Ainsi, plusieurs étapes critiques sont nécessaires pour mener à bien des expériences NSE et collecter des données de haute qualité. Une étape clé pour assurer l’utilisation efficace du temps de fais.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts et n’ont rien à divulguer.
Remerciements
R. Ashkar remercie M. Nagao, L.-R. Stingaciu et P. Zolnierczuk pour de nombreuses discussions utiles et pour leur aide fréquente dans les expériences NSE sur leurs lignes de faisceau respectives. Les auteurs reconnaissent l’utilisation de spectromètres d’écho de spin neutronique au NIST et à l’ORNL. Le spectromètre NSE du NIST est soutenu par le Center for High Resolution Neutron Scattering, un partenariat entre le National Institute of Standards and Technology et la National Science Foundation en vertu de l’accord no. DMR-1508249. Le spectromètre NSE de la source de neutrons de spallation de l’ORNL est soutenu par la Division des installations pour les utilisateurs s....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Chloroforme (qualité biotechnologique) | Sigma Aldrich | 496189 | Catégorie biotechnologique, &ge ; 99,8 %, contient 0,5 à 1,0 % d’éthanol comme stabilisant |
| Bain d’eau en circulation | Julabo | SE-12 | Circulateur de chauffage avec pompe intelligente, réglages de température programmables et connexion de capteur externe pour la mesure et le contrôle |
| Oxyde de deutérium | Cambridge Isotopes Laboratories | DLM-4 | Eau deutérée ; Eau lourde (D2O) (D, 99.9 %) |
| Semi-microbalance numérique | Mettler Toledo | MS105 | Semi-microbalance d’une capacité de 120 g, d’une précision d’affichage de 0,01 mg, d’une cellule de pesée haute résolution, de portes ergonomiques et d’une application de contrôle de pipette |
| Éthanol (qualité biologie moléculaire) | Sigma Aldrich | E7023 | Éthanol 200 proof pour applications de biologie moléculaire |
| Pipettes en verre | VWR | 36360-536 | Verre sodocalcique jetable Pipettes Pasteur |
| Flacons en verre | Thermo Scientific | B7990-1 | Flacons en verre borosilicaté avec bouchons de septum PTFE/Silione |
| Congélateur de laboratoire | Fisher Scientific | IU2886D | Congélateur à ultra-basse température (-86 à -50 °C) pour le stockage à long terme des lipides et des protéines |
| Lipides (protaités ou perdeutérés) | Avanti Polar Lipids | varie selon les lipides | Les lipides peuvent être achetés auprès d’Avanti sous forme de poudre ou dans une solution de chloroforme avec les quantités et les schémas de deutération requis. |
| Purificateur d’eau Millipore Millipore | Sigma | ZRQSVP3US | Direct-Q® ; ; 3 Système de purification d’eau UV qui fournissent de l’eau pure et ultra-pure avec une lampe UV intégrée pour réduire les niveaux de matières organiques pour les produits biologiques. applications |
| Kit de mini-extrudeuse | Avanti Polar Lipids | 610020 | Le kit de mini-extrudeuse comprend une mini-extrudeuse, un bloc chauffant, 2 seringues étanches au gaz et 2 joints toriques, des membranes en polycarbonate et des supports de filtre |
| Raccords à connexion rapide | Grainger | 2YDA1 et 2YDA7 | Raccords de tube à bouton-poussoir pour les applications de circulation d’eau QuickConnect, par exemple l’extrusion de vésicules à haute température |
| Pompe | à seringueSyringePump.com | New Era-1000 | Pousse-seringue entièrement programmable pour la perfusion et le prélèvement ; programme jusqu’à 41 phases de pompage avec des débits de pompage, des volumes distribués et des cycles d’extrusion réglables |
| Bain à ultrasons | Fisher Scientific | CPX2800 | Bain ultrasonique à température contrôlée avec fonctionnalité programmable pour les applications de dégazage et d’ultrasons |
| Four à vide | Thermo Scientific | 3608 | Four sous vide de 0,7 pi³ avec thermostat intégré à limite haute protection contre la surchauffe |
| Mélangeur vortex | Fisher Scientific | 02-215-414 | Vitesse variable, commande analogique qui permet un démarrage à bas régime pour une agitation douce ou un mélange à grande vitesse pour un vortex vigoureux des échantillons |
Références
- Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175 (4023), 720-731 (1972).
- Andersen, O. S., Koeppe, R. E. Bilayer thickness and membrane protein function: an energetic perspective. Annual ....
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions
Posted by JoVE Editors on 8/06/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Neutron Spin Echo Spectroscopy as a Unique Probe for Lipid Membrane Dynamics and Membrane-Protein Interactions. The Introduction, Protocol, and Representative Results sections have been updated.
In the Introduction, the fith pargraph was updated from:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
to:
Besides direct access to the length and time scale of membrane dynamics, NSE has the inherent capabilities of neutron isotope sensitivity52. Specifically, the ability of neutrons to interact differently with the isotopes of hydrogen, the most abundant element in biological systems, results in a different neutron scattering length density,34 or NSLD (the equivalent of the optical index of refraction50), when protium is substituted by deuterium. This enables an approach known as contrast variation, which is commonly used to highlight specific membrane features or conceal others — the latter scenario is referred to as contrast matching. A frequent application of contrast variation/matching is the substitution of water (NSLD = -0.56 × 10-6 Å-2) by heavy water or D2O (NSLD = 6.4 × 10-6 Å-2) to amplify the neutron signal from protiated lipid membranes (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2). This approach is highly effective in studies of membrane structure because the penetration of D2O into the headgroup region of the membrane allows accurate determination of the membrane thicknesses (see Figure 2A, left panel) and of the location of different lipid subgroups when more sophisticated models are applied53,54. This paper highlights some examples on the use of contrast variation for studies of collective dynamics in biomimetic membranes and select membrane features.
In the Protocol, step 1.1 was updated from:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 2 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
to:
For bending fluctuation measurements, make fully protiated liposomes in D2O (D 99.9%) or D2O-buffer (e.g., phosphate buffer prepared with D2O instead of H2O). Use fully protiated DMPC (C36H72NO8P) and DSPC (C44H88NO8P) with 133.4 mg, where XDMPC and XDSPC are the mole fractions of DMPC and DSPC, here set to 0.7 and 0.3, respectively, and MwDMPC and MwDSPC are the molar weights given by 677.9 g/mol and 790.1 g/mol, respectively. Similarly, mDSPC = 66.6 mg. This deuteration scheme increases the scattering contrast between the membrane (NSLD ~ 0 × 10-6 Å-2) and the deuterated buffer (NSLD ~ 6.4 × 10-6 Å-2) and amplifies the signal from membrane undulations (see Figure 2A left panel).
In the Representative Results, the fist pagargaph was updted from:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: 
, where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~2 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
to:
NSE studies accessing bending fluctuations are typically performed over a Q-range of ~ (0.04 - 0.2) Å-1. This Q-range corresponds to intermediate length scales between the membrane thickness and the liposomal radius, where bending dynamics dominate. Measurement over an extended Q-range can give access to additional dynamic modes, including liposomal diffusion and intramembrane dynamics. For more details on the cross-over in membrane dynamics accessed by NSE, check these relevant publications25,71. It is important to emphasize that NSE signals are proportional to: , where Icoh and Iinc are, respectively, the coherent and incoherent scattering intensity from the sample. Therefore, it is advisable to prepare NSE liposomal samples in deuterated buffers (i.e., buffers prepared with D2O instead of H2O) to minimize the incoherent scattering signal, mainly contributed by the hydrogen content of the sample. However, in some cases intermediate deuteration schemes (i.e., using mixtures of D2O and H2O) might be necessary to obtain optimal contrast conditions. Typically, NSE measurements of membrane bending fluctuations are performed on fully protiated liposomes in deuterated buffer, referred to as fully contrasted liposomes in Figure 5. This deuteration scheme results in a large NSLD difference between the membrane core (~0 × 10-6 Å-2) and its deuterated fluid environment (~6.4 × 10-6 Å-2), which significantly enhances the scattering signal from the liposomal membranes and improves the measurement statistics of bending dynamics. This contrast scheme (Figure 2A left panel) is frequently utilized in studies of bending rigidity of lipid membranes with single38,72 and multiple39,66 lipid components and in studies of membrane softening/stiffening by biological inclusions (e.g., cholesterol, drug molecules, peptides/proteins)36,37,73,74,75, and synthetic additives (e.g., nanoparticles)76,77.
In the Representative Reults, Figure 2 was updated from:
Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the headgroup (~2 × 10-2 Å-2) and tail region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.
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Figure 2: Examples of possible deuteration schemes in NSE experiments on lipid membranes. (A) Left: Fully contrasted membranes, e.g., protiated membranes in deuterated buffer, showing the NSLD profile along the normal to the membrane surface. The difference in the NSLD between the tail region (~0 × 10-2 Å-2) and headgroup region (~4.5 × 10-6 Å-2) of the membrane is due to the headgroup hydration with deuterated buffer. Right: Tail-contrast matched membranes such that the hydrocarbon tail region of the membrane has the same NSLD as the buffer, as shown in the corresponding NSLD profile along the membrane normal. (B) Domain-forming membranes with two neutron contrast schemes where the domains (center) or the matrix (left) are contrast-matched to the buffer, enabling selective studies of matrix or domain dynamics, respectively. This figure has been modified from Nickels et al., JACS 201541. (C) Asymmetric membranes prepared by cyclodextrin exchange between protiated and deuterated lipid vesicles, resulting in the deuteration of one membrane leaflet while keeping the other leaflet protiated. This allows studies of the bending dynamics of the protiated leaflet and provides insights into the mechanical coupling between opposing leaflets in asymmetric membranes. This figure has been modified from Rickeard et al., Nanoscale 202040. Please click here to view a larger version of this figure.
