Spectroscopie d’écho de spin neutronique en tant que sonde unique pour la dynamique de la membrane lipidique et les interactions membrane-protéine

Summary

Cet article décrit les protocoles de préparation des échantillons, de réduction des données et d’analyse des données dans les études d’écho de spin neutronique (NSE) des membranes lipidiques. Le étiquetage judicieux des lipides au deutérium permet d’accéder à différentes dynamiques membranaires sur des échelles de longueur et de temps mésoscopiques, sur lesquelles se produisent des processus biologiques vitaux.

Abstract

Les bicouches lipidiques forment la matrice principale des membranes cellulaires et constituent la principale plate-forme pour l’échange de nutriments, les interactions protéine-membrane et le bourgeonnement viral, entre autres processus cellulaires vitaux. Pour une activité biologique efficace, les membranes cellulaires doivent être suffisamment rigides pour maintenir l’intégrité de la cellule et de ses compartiments, mais suffisamment fluides pour permettre aux composants membranaires, tels que les protéines et les domaines fonctionnels, de diffuser et d’interagir. Cet équilibre délicat des propriétés des membranes élastiques et fluides, et leur impact sur la fonction biologique, nécessitent une meilleure compréhension de la dynamique collective des membranes sur les échelles de longueur et de temps mésoscopiques des processus biologiques clés, par exemple les déformations membranaires et les événements de liaison aux protéines. Parmi les techniques qui peuvent sonder efficacement cette plage dynamique, il y a la spectroscopie par écho de spin neutronique (NSE). Combiné au labelage au deutérium, le NSE peut être utilisé pour accéder directement aux fluctuations de flexion et d’épaisseur ainsi qu’à la dynamique mésoscopique de certaines caractéristiques de la membrane. Cet article fournit une brève description de la technique NSE et décrit les procédures pour effectuer des expériences NSE sur les membranes liposomales, y compris des détails sur les schémas de préparation et de deutération des échantillons, ainsi que des instructions pour la collecte et la réduction des données. L’article présente également des méthodes d’analyse de données utilisées pour extraire des paramètres clés de la membrane, tels que le module de rigidité de flexion, le module de compressibilité de surface et la viscosité dans le plan. Pour illustrer l’importance biologique des études NSE, certains exemples de phénomènes membranaires sondés par NSE sont discutés, à savoir l’effet des additifs sur la rigidité de flexion de la membrane, l’impact de la formation de domaine sur les fluctuations membranaires et la signature dynamique des interactions membrane-protéine.

Introduction

La compréhension des membranes cellulaires et de leur fonction a remarquablement évolué au cours des dernières décennies. L’ancienne vision des membranes cellulaires en tant que bicouches lipidiques passives qui définissent les limites cellulaires et abritent les protéines membranaires¹ s’est progressivement transformée en un modèle dynamique dans lequel les bicouches lipidiques jouent un rôle important dans la régulation des processus biologiques vitaux, y compris la signalisation cellulaire, l’échange moléculaire et la fonction protéique – pour n’en nommer que quelques-uns^2,3,^4,5,6. Cette prise de conscience que les membranes cellulaires sont très dynamiques, en constante évolution et redistribution moléculaire, a poussé les explorations scientifiques au-delà des structures d’équilibre des membranes^7,8,9. En conséquence, de multiples approches ont été développées pour étudier les différents modes dynamiques dans les membranes lipidiques biologiques et bioinspirées. À ce jour, la majorité de ces études se sont principalement concentrées sur les mouvements moléculaires diffusifs^10,11,12,13 et les fluctuations de forme macroscopiques^14,15,16, laissant une lacune significative dans la compréhension de la dynamique membranaire intermédiaire, c’est-à-dire les fluctuations collectives des assemblages lipidiques constitués de quelques 10 à 100 molécules lipidiques. Ces dynamiques se produisent sur des échelles de longueur de quelques dizaines à quelques 100 Å et sur des échelles de temps de sous-ns à quelques centaines de ns (voir figure 1),appelées ici échelles mésoscopiques. C’est en effet à ces échelles que l’activité biologique clé a lieu au niveau de la membrane^17. Cela inclut le bourgeonnement viral¹⁸, le canal gating¹⁹et les interactions membrane-protéine²⁰. Il est également important de souligner que le paysage énergétique des protéines membranaires^21,22 montre que les changements conformationnels dans les protéines – nécessaires à leur rôle régulateur – se produisent sur les échelles de temps ns²³ des fluctuations membranaires collectives, soulignant davantage l’importance de la dynamique mésoscopique dans la fonction biologique des membranes cellulaires et de leurs analogues bioinspirés²⁰. Cet article se concentre sur les deux principaux modes dynamiques mésoscopiques dans les membranes lipidiques, à savoir les fluctuations de flexion et les fluctuations d’épaisseur.

Le principal défi pour sonder directement ces modes de fluctuation est la difficulté d’accéder simultanément à leurs échelles spatiales et temporelles à l’aide de méthodes de spectroscopie standard. L’autre défi est que les techniques de contact direct pourraient avoir un impact sur les mêmes fluctuations qu’elles sont censées mesurer¹⁶. Ceci est encore exacerbé par la complexité compositionnelle et structurelle des membranes biologiques^24,25, qui se traduit par des caractéristiques membranaires non homogènes, y compris la formation de domaine lipidique^{26,27,28,29,30} et l’asymétrie membranaire^31,32,33– exigeant des sondes sélectives pour comprendre la dynamique des différentes caractéristiques de la membrane. Heureusement, ces défis peuvent être surmontés avec des méthodes de spectroscopie neutronique non invasives, telles que l’écho de spin neutronique (NSE), qui accèdent intrinsèquement aux échelles de longueur et de temps requises, et permettent d’autres études des caractéristiques sélectives de la membrane sans modifier leur environnement physico-chimique³⁴. En effet, au cours des dernières années, la spectroscopie NSE a évolué pour devenir une sonde unique et puissante de dynamique membranaire collective^35. Les résultats des études NSE sur les membranes lipidiques ont produit de nouvelles connaissances sur les propriétés mécaniques^36,37 et viscoélastiques^38,39 des membranes lipidiques et ont jeté un nouvel éclairage sur leur rôle potentiel dans la fonction biologique^40,41.

La technique de spectroscopie NSE est basée sur une conception d’instrument interférométrique, proposée pour la première fois par Mezei^42,utilisant une série de spin-flippers et de bobines magnétiques pour contrôler la précession du spin neutronique lorsque les neutrons traversent l’instrument. La conception repose sur la mise en miroir magnétique des éléments du champ magnétique par rapport à la position de l’échantillon(Figure 1A). Cela implique qu’en l’absence d’échange d’énergie entre le neutron et l’échantillon, le neutron effectue le même nombre de précessions de spin, dans des directions opposées, dans la première et la deuxième moitié de l’instrument (remarquez le π-flipper entre les deux bobines de précession). En conséquence, l’état de spin final du neutron reste inchangé par rapport à l’état initial – un phénomène appelé écho de spin (voir neutron transparent à la figure 1A). Cependant, lorsque le neutron interagit énergétiquement avec l’échantillon, l’échange d’énergie modifie le nombre de précessions de spin dans la seconde moitié de l’instrument, conduisant à un état de spin final différent (voir Figure 1A). Ceci est détecté expérimentalement comme une perte de polarisation, comme nous le verrons plus loin dans cet article. Pour plus de détails sur la technique NSE, le lecteur est référé aux documents techniques dédiés^42,43,44,45.

Ici, une description simplifiée est présentée pour fournir une estimation approximative de la durée et des échelles de temps accessibles avec NSE. Les échelles de longueur sont déterminées par la gamme des transferts de vecteurs d’onde réalisables, Q = 4π sin θ/λ, où 2θ est l’angle de diffusion et λ est la longueur d’onde du neutron. On peut voir que Q est défini par la gamme de longueurs d’onde et l’étendue de rotation du deuxième bras du spectromètre (voir Figure 1A). Une plage Qtypique sur les spectromètres NSE est ~0,02-2 Å^-146,47, et jusqu’à 0,01-4 Å^-1 avec des mises à niveau récentes^48,49, correspondant à des échelles spatiales de ~ 1-600 Å. D’autre part, l’échelle de temps accessible est calculée à partir de l’angle total de précession (ou phase) acquis par le neutron à l’intérieur des bobines de précession magnétique, et se trouve être^{de 50}: . Dans cette expression, t est le temps de Fourier défini comme , où est le rapport gyromagnétique des neutrons, est la longueur de la bobine et est la force du champ magnétique de la bobine. Il convient de souligner que le temps de Fourier est une quantité qui dépend strictement de la géométrie de l’instrument, de l’intensité du champ magnétique et de la longueur d’onde des neutrons. Par exemple, en utilisant des neutrons de longueur d’onde = 8 Å et des réglages d’instrument de   = 1,2 m et = 0,4 T, le temps de Fourier est calculé à t ~ 50 ns. Expérimentalement, le temps de Fourier est réglé en modifiant le courant dans les bobines de précession (c’est-à-dire l’intensité du champ magnétique) ou en utilisant différentes longueurs d’onde de neutrons, ce qui donne des échelles de temps NSE typiques de ~ 1 ps à 100 ns. Cependant, les récentes mises à niveau des spectromètres NSE ont permis d’accéder à des temps de Fourier plus longs, jusqu’à ~400 ns sur le spectromètre J-NSE-Phoenix au Heinz Maier-Leibnitz Zentrum⁵¹ et le spectromètre SNS-NSE au Oak Ridge National Lab^48,et jusqu’à ~1 000 ns au spectromètre IN15 NSE à l’Institut Laue-Langevin (ILL)⁴⁹. 

Outre l’accès direct à la durée et à l’échelle de temps de la dynamique membranaire, NSE a les capacités inhérentes de la sensibilité isotopique^{neutronique 52}. Plus précisément, la capacité des neutrons à interagir différemment avec les isotopes de l’hydrogène, l’élément le plus abondant dans les systèmes biologiques, entraîne une densité de longueur de diffusion des neutrons différente,³⁴ ou NSLD (l’équivalent de l’indice optique de réfraction^50),lorsque le protium est substitué par du deutérium. Cela permet une approche connue sous le nom de variation de contraste, qui est couramment utilisée pour mettre en évidence des caractéristiques spécifiques de la membrane ou en dissimuler d’autres – ce dernier scénario est appelé correspondance de contraste. Une application fréquente de variation/correspondance de contraste est la substitution de l’eau (NSLD = -0,56 × 10^-6 Å^-2) par de l’eau lourde ou_D2O (NSLD = 6,4 × 10^-6 Å^-2) pour amplifier le signal neutronique des membranes lipidiques protiées (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). Cette approche est très efficace dans les études de la structure membranaire car la pénétration de D₂O dans la région du groupe de tête de la membrane permet de déterminer avec précision les épaisseurs de membrane (voir Figure 2A,panneau de gauche) et de l’emplacement des différents sous-groupes lipidiques lorsque des modèles plus sophistiqués sont appliqués^53,54. Cet article met en évidence quelques exemples sur l’utilisation de la variation de contraste pour les études de la dynamique collective dans les membranes biomimétiques et certaines caractéristiques membranaires.

Ici, l’efficacité de NSE à fournir des informations uniques sur les propriétés dynamiques et fonctionnelles des membranes est illustrée par des exemples tangibles d’études NSE sur des systèmes de membranes lipidiques modèles et biologiquement pertinents en mettant l’accent sur la dynamique à méso-échelle dans les membranes autoportantes, sous la forme de suspensions liposomales. Pour les mesures NSE de la dynamique des membranes dans le plan, le lecteur est référé à des publications dédiées sur la spectroscopie d’écho-spin neutronique d’incidence de pâturage (GINSES)^55,56 et d’autres études de piles de membranes multilamellaires alignées^57,58,59,60.

Pour simplifier, cet article met en évidence trois schémas différents de deutération membranaire illustrés sur un système de bicouche lipidique bien étudié formant ou séparant les phases de mélanges de 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC) et de 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)^61,62. Les deux lipides sont caractérisés par un décalage dans leur longueur de chaîne hydrocarbonée (14 carbones/queue en DMPC vs 18 carbones/queue en DSPC) et leur température de transition gel-fluide (T_{m, DMPC} = 23 °C vs T_{m, DSPC} = 55 °C). Il en résulte une séparation latérale de phase dans les membranes DMPC:DSPC à des températures comprises entre les températures de transition supérieures et inférieures du mélange⁶³. Les schémas de deutération considérés ici sont choisis pour démontrer les différents modes dynamiques accessibles dans les mesures NSE sur les membranes liposomales, à savoir les fluctuations de flexion, les fluctuations d’épaisseur et les fluctuations sélectives de flexion / épaisseur des domaines latéraux. Toutes les compositions lipidiques sont rapportées pour les bicouches DMPC:DSPC préparées à une fraction molaire de 70:30, en utilisant des variantes protiées et perdeuterées de DMPC et DSPC disponibles dans le commerce. Toutes les étapes de préparation de l’échantillon sont basées sur 4 mL de suspension liposomale, en D₂O, avec une concentration lipidique de 50 mg/mL, pour une masse lipidique totale de M_tot = 200 mg par échantillon.

Protocol

1. Schéma de deutération requis pour l’expérience Pour les mesures de fluctuation de flexion, faire des liposomes entièrement protiés dans D2O (D 99,9%) ou D2O-tampon (par exemple, tampon phosphate préparé avec D2O au lieu de H2O). Utilisez du DMPC entièrement protié (C36H72NO8P) et du DSPC (C44H88NO8P) avec 133,4 mg, où <e…

Representative Results

Les études NSE accédant aux fluctuations de flexion sont généralement réalisées sur une plage Q de ~ (0,04 – 0,2) Å-1. Cette gamme Q correspond à des échelles de longueur intermédiaires entre l’épaisseur de la membrane et le rayon liposomal, où la dynamique de flexion domine. La mesure sur une plage Q étendue peut donner accès à des modes dynamiques supplémentaires, y compris la diffusion liposomale et la dynamique intramembranaire. Pour plus de détails sur le cross-over dans la dynamique me…

Discussion

NSE est une technique puissante et unique dans la mesure de la dynamique mésoscopique des membranes lipidiques dans diverses conditions. L’utilisation efficace de la NSE dépend de la qualité de l’échantillon, du contraste des neutrons et de la gamme de dynamiques accessibles qui peuvent être sondées pour un échantillon donné. Ainsi, plusieurs étapes critiques sont nécessaires pour mener à bien des expériences NSE et collecter des données de haute qualité. Une étape clé pour assurer l’utilisation eff…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples