ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים כגשוש ייחודי לדינמיקה של קרום השומנים ואינטראקציות בין חלבון ממברנה

Summary

מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים להכנת מדגם, הפחתת נתונים וניתוח נתונים במחקרי הד ספין נויטרונים (NSE) של ממברנות השומנים. תיוג דיטריום נבון של שומנים מאפשר גישה לדינמיקה שונה של ממברנה על קשקשי אורך וזמן מזוסקופיים, שעליהם מתרחשים תהליכים ביולוגיים חיוניים.

Abstract

דו-שכבתיים שומנים מהווים את המטריצה העיקרית של קרום התא והם הפלטפורמה העיקרית לחילופי חומרים מזינים, אינטראקציות בין קרום חלבון וניצנים ויראליים, בין תהליכים תאיים חיוניים אחרים. לפעילות ביולוגית יעילה, קרום התא צריך להיות נוקשה מספיק כדי לשמור על שלמות התא ותאיו עדיין נוזל מספיק כדי לאפשר רכיבי ממברנה, כגון חלבונים ותחומים פונקציונליים, לפזר אינטראקציה. איזון עדין זה של תכונות ממברנה אלסטית וזורמת, והשפעתם על התפקוד הביולוגי, מחייבים הבנה טובה יותר של דינמיקת הממברנה הקולקטיבית על פני סולמות אורך וזמן מסוסקופיים של תהליכים ביולוגיים מרכזיים, למשל, עיוותי ממברנה ואירועי כריכת חלבונים. בין הטכניקות שיכולות לחקור ביעילות טווח דינמי זה הוא ספקטרוסקופיית הד ספין נויטרונים (NSE). בשילוב עם תיוג דיטריום, NSE יכול לשמש כדי לגשת ישירות כיפוף ותנודות עובי, כמו גם דינמיקה מסוסקופית של תכונות ממברנה נבחרות. מאמר זה מספק תיאור קצר של טכניקת NSE ומתאר את ההליכים לביצוע ניסויי NSE על ממברנות liposomal, כולל פרטים של הכנה מדגם תוכניות deuteration, יחד עם הוראות לאיסוף נתונים והפחתת. המאמר מציג גם שיטות ניתוח נתונים המשמשות לחילוץ פרמטרים מרכזיים של ממברנה, כגון מודולוס קשיחות כיפוף, מודולוס דחיסת שטח וצמיגות בתוך המטוס. כדי להמחיש את החשיבות הביולוגית של מחקרי NSE, דוגמאות נבחרות לתופעות ממברנה הנבדקות על ידי NSE נדונות, כלומר, ההשפעה של תוספים על קשיחות כיפוף הממברנה, ההשפעה של היווצרות תחום על תנודות ממברנה, ואת החתימה הדינמית של אינטראקציות חלבון ממברנה.

Introduction

ההבנה של קרום התא ותפקודם התפתחה להפליא בעשורים האחרונים. ההשקפה הקודמת של קרום התא כביבאי שומנים פסיביים המגדירים את גבולות התא וחלבוני קרום הבית¹ הפכה בהדרגה למודל דינמי שבו דו-שכבתי השומנים ממלאים תפקיד חשוב בוויסות תהליכים ביולוגיים חיוניים, כולל איתות תאי, החלפה מולקולרית ותפקוד חלבונים – אם להזכיר כמה^2,3,4,5,6. הבנה זו כי קרום התא הם דינמיים מאוד, כל הזמן עובר שיפוץ וחלוקה מולקולרית, דחף מחקרים מדעיים מעבר למבני שיווי משקל של ממברנות^7,8,9. בהתאם, פותחו גישות מרובות כדי לחקור את המצבים הדינמיים השונים בממברנות שומנים ביולוגיות וביואינספיריות. עד כה, רוב המחקרים התמקדו בעיקר בתנועות מולקולריות מפוזרות^{10,11,12,13 ותנודות} צורה מקרוסקופיות^14,15,16, משאיר פער משמעותי בהבנת דינמיקת ממברנה ביניים, כלומר, תנודות קולקטיביות של מכלולי שומנים המורכבים כמה 10-100s של מולקולות השומנים. דינמיקה זו מתרחשת על פני סולמות אורך של כמה עשרות עד כמה 100 Å ועם הזמן סולמות של sub-ns עד כמה מאות ns (ראה איור 1), המכונה כאן קשקשים מסוסקופיים. זה אכן בקנה מידה זה כי פעילות ביולוגית מפתח מתרחשת ברמה הממברנה¹⁷. זה כולל ניצנים ויראליים¹⁸, ערוץ gating¹⁹, ו אינטראקציות חלבון ממברנה²⁰. חשוב גם לציין כי הנוף האנרגטי של חלבוני הממברנה^21,22 מראה כי שינויים קונפורמציה בחלבונים – הכרחיים לתפקידם הרגולטורי – מתרחשים לאורך סולמות הזמן ns²³ של תנודות ממברנה קולקטיבית, תוך הדגשת החשיבות של דינמיקה מסוסקופית בתפקוד הביולוגי של קרום התא והאנלוגיות הביו-השראה שלהם²⁰. מאמר זה מתמקד בשני המצבים הדינמיים המזוסקופיים העיקריים בממברנות השומנים, כלומר, תנודות כיפוף ותנודות עובי.

האתגר העיקרי בוחן ישיר מצבי תנודות אלה הוא הקושי לגשת בו זמנית לקנה המידה המרחבי והזמן שלהם בשיטות ספקטרוסקופיה סטנדרטיות. האתגר השני הוא שטכניקות מגע ישיר יכולות להשפיע על אותן תנודות שהן אמורות למדוד¹⁶. זה מחמיר עוד יותר על ידי המורכבות הרכב ומבנית של ממברנות ביולוגיות^24,25, אשר התוצאה היא תכונות ממברנה לא הומוגנית, כולל היווצרות תחום השומנים^{26,27,28,29,30} ו אסימטריה ממברנה^31,32,33– דורש בדיקות סלקטיביות כדי להבין את הדינמיקה של תכונות ממברנה שונות. למרבה המזל, ניתן להתגבר על אתגרים אלה בשיטות ספקטרוסקופיה לא פולשניות של נויטרונים, כגון הד ספין נויטרונים (NSE), אשר מטבען לגשת קשקשי האורך וזמן הנדרשים, ולאפשר עוד יותר מחקרים של תכונות ממברנה סלקטיבית מבלי לשנות את הסביבה הפיזיקוכימית שלהם³⁴. ואכן, במהלך השנים האחרונות ספקטרוסקופיית NSE התפתחה לגשוש ייחודי ורב עוצמה של דינמיקת הממברנה הקולקטיבית³⁵. תוצאות מחקרי NSE על ממברנות השומנים הפיקו תובנות חדשות על מכני^36,37 ו צמיג^38,39 תכונות של ממברנות השומנים לשפוך אור חדש על תפקידם הפוטנציאלי בתפקוד הביולוגי^40,41.

טכניקת הספקטרוסקופיה של NSE מבוססת על עיצוב מכשיר אינטרפרומטרי, שהוצע לראשונה על ידי Mezei⁴², באמצעות סדרה של ספין סנפירים סלילים מגנטיים כדי לשלוט על הקדירה של ספין הנויטרונים כמו נייטרונים לחצות את המכשיר. העיצוב נשען על שיקוף מגנטי של יסודות השדה המגנטי ביחס למיקום המדגם(איור 1A). משמעות הדבר היא כי בהיעדר חילופי אנרגיה בין הנויטרונים לדגימה, הנויטרונים מבצעים את אותו מספר של נטיות ספין, בכיוונים מנוגדים, במחצית הראשונה והשנייה של המכשיר (שימו לב π-סנפיר בין שני סלילי ההקדמה). כתוצאה מכך, מצב הספין הסופי של הנויטרונים נותר ללא שינוי ביחס למצב ההתחלתי – תופעה המכונה ספין-הד (ראו נויטרונים שקופים באיור 1A). עם זאת, כאשר הנויטרונים מתקשרים במרץ עם המדגם, חילופי האנרגיה משנה את מספר ההטיות בסיבוב במחצית השנייה של המכשיר, מה שמוביל למצב ספין סופי אחר (ראו איור 1A). זה מזוהה באופן ניסיוני כהפסד בקיטוב, כפי שיוצג בהמשך מאמר זה. לקבלת פרטים נוספים על טכניקת NSE, הקורא מופנה מאמרים טכניים ייעודיים^42,43,44,45.

כאן, תיאור פשוט מוצג כדי לספק הערכה גסה של סולמות האורך והשעה הנגישים עם NSE. סולמות האורך נקבעים על ידי טווח העברות wavevector בר השגה, Q = 4π sin θ/ λ, שבו2 θ הוא זווית הפיזור ו λ הוא אורך הגל הנויטרונים. ניתן לראות ש-Q מוגדר על ידי טווח אורך הגל והיקף הסיבוב של הזרוע השנייה של הספקטרומטר (ראו איור 1A). טווח Qטיפוסי על ספקטרומטרים NSE הוא ~ 0.02-2 Å^-146,47, ועד 0.01-4 Å^-1 עם שדרוגים אחרונים^48,49, המקביל לקנה מידה מרחבי של ~ 1-600 Å. מצד שני, סולם הזמן הנגיש מחושב מזווית ההקדמה הכוללת (או השלב) שנרכשה על ידי הנויטרונים בתוך סלילי ההקדמה המגנטית, ונמצא⁵⁰: . בביטוי זה, t הוא זמן פורייה המוגדר כ, איפה היחס הגירומגנטי של הנויטרונים, הוא אורך סליל, והוא כוחו של השדה המגנטי של סליל. ראוי לציין כי זמן פורייה הוא כמות התלויה לחלוטין בגיאומטריית המכשיר, חוזק השדה המגנטי ואורך הגל הנויטרונים. לדוגמה, באמצעות נייטרונים של אורך גל = 8 Å והגדרות מכשיר של   = 1.2 מ ‘ ו – 0.4 T, זמן פורייה מחושב להיות t ~ 50 ns. באופן ניסיוני, זמן פורייה מכוון על ידי שינוי הזרם בסלילי הקדם (כלומר, חוזק השדה המגנטי) או באמצעות אורכי גל נויטרונים שונים, וכתוצאה מכך סולמות זמן טיפוסיים של NSE של ~ 1 ps עד 100 ns. עם זאת, שדרוגים אחרונים בספקטרומטר NSE אפשרו גישה לזמנים ארוכים יותר של פורייה, עד כ-400 נ’ב בספקטרומטר J-NSE-Phoenix בספקטרומטר היינץ מאייר-לייבניץ זנטרום⁵¹ וספקטרומטר SNS-NSE במעבדה הלאומית אוק רידג’⁴⁸, ועד ~ 1,000 ns בספקטרומטר IN15 NSE במכון לאו-לנגווין (ILL)⁴⁹. 

מלבד גישה ישירה לאורך ולקנה המידה של דינמיקת הממברנה, ל- NSE יש את היכולות הטבועות של רגישות איזוטופ נויטרונים⁵². באופן ספציפי, היכולת של נייטרונים לקיים אינטראקציה שונה עם האיזוטופים של מימן, היסוד הנפוץ ביותר במערכות ביולוגיות, גורמת לצפיפות אורך פיזור נויטרונים שונה,³⁴ או NSLD (המקבילה של האינדקס האופטי של שבירה⁵⁰), כאשר פרוטיום מוחלף על ידי דיטריום. זה מאפשר גישה המכונה וריאציה ניגודית, אשר משמש בדרך כלל כדי להדגיש תכונות ממברנה ספציפיות או להסתיר אחרים – התרחיש האחרון מכונה התאמת ניגוד. יישום תכוף של וריאציה /התאמה ניגודיות הוא החלפת מים (NSLD = -0.56 × 10^-6 Å^-2) על ידי מים כבדים או D₂O (NSLD = 6.4 × 10^-6 Å^-2) כדי להגביר את אות הנויטרונים מקרום השומנים פרוטיים (NSLD ~ 0 × 10^-6 Å^-2). גישה זו יעילה מאוד במחקרים של מבנה הממברנה מכיוון שחדירת D₂O לאזור קבוצת הראש של הממברנה מאפשרת קביעה מדויקת של עובי הממברנה (ראה איור 2A, פאנל שמאלי) ושל המיקום של קבוצות משנה שומנים שונות כאשר מודלים מתוחכמים יותר מוחלים^53,54. מאמר זה מדגיש כמה דוגמאות על השימוש וריאציה ניגודיות למחקרים של דינמיקה קולקטיבית בממברנות biomimetic ותכונות ממברנה לבחור.

כאן, האפקטיביות של NSE במתן תובנות ייחודיות על תכונות ממברנה דינמית ופונקציונלית מודגמת באמצעות דוגמאות מוחשיות של מחקרי NSE על מודל ומערכות קרום שומנים רלוונטיות ביולוגית עם דגש על דינמיקה mesoscale בממברנות עצמאיות, בצורה של מתלים liposomal. עבור מדידות NSE של דינמיקת ממברנה בתוך המטוס, הקורא מתייחס פרסומים ייעודיים על ספקטרוסקופיית ספין-הד-הד של נויטרונים (GINSES)^55,56 ומחקרים אחרים של ערימות ממברנה רב-שלמית מיושרות^57,58,59,60.

לפשטות, מאמר זה מדגיש שלוש תוכניות שונות של פירוק ממברנה מאויר על דומיין נחקר היטב, או הפרדת פאזה, מערכת bilayer השומנים של 1,2-dimyristoyl-sn-גליצרי-3-פוספוצולין (DMPC) ו 1,2-distearoyl-sn-גלייצרו-3-פוספוצולין (DSPC) תערובות^61,62. שני השומנים מאופיינים בחוסר התאמה באורך שרשרת הפחמימנים שלהם (14 פחמנים/זנב ב- DMPC לעומת 18 פחמנים /זנב ב- DSPC) וטמפרטורת המעבר של נוזל הג’ל שלהם (T_{m, DMPC} = 23 °C לעומת T_{m, DSPC} = 55 °C (C). התוצאה היא הפרדת פאזה לרוחב ב DMPC: DSPC ממברנות בטמפרטורות בין טמפרטורות המעבר העליונות והתחתונות של התערובת⁶³. תוכניות ההסתה הנחשבות כאן נבחרות כדי להדגים את המצבים הדינמיים השונים הנגישים במדידות NSE על ממברנות ליפוזומליות, כלומר, תנודות כיפוף, תנודות עובי ותנודות כיפוף / עובי סלקטיביות של תחומים לרוחב. כל הרכבי השומנים מדווחים עבור DMPC:DSPC bilayers מוכן בשבר שומה של 70:30, באמצעות גרסאות פרוטציה ו perdeuterated זמין מסחרית של DMPC ו- DSPC. כל שלבי הכנת המדגם מבוססים על 4 מ”ל של השעיה ליפוזומית, ב D₂O, עם ריכוז שומנים בדם של 50 מ”ג /מ”ל, עבור מסת שומנים כוללת של M_tot = 200 מ”ג לדגימה.

Protocol

1. ערכת ההסתה הנדרשת לניסוי למדידות תנודות כיפוף, הכינו ליפוזומים פרוטיים לחלוטין ב- D2O (D 99.9%) או D2O-buffer (למשל, מאגר פוספט שהוכן עם D2O במקום H2O). השתמש DMPC protiated מלא (C36H72NO8P) ו- DSPC (C44H88NO8P) עם 133.4 מ”ג, …

Representative Results

מחקרי NSE גישה לתנודות כיפוף מבוצעים בדרך כלל על פני טווח Q של ~ (0.04 – 0.2) Å-1. טווח Q זה מתאים לקשקשי אורך ביניים בין עובי הממברנה לרדיוס הליפוזום, שבו דינמיקת הכיפוף שולטת. מדידה על פני טווח Q מורחב יכולה להעניק גישה למצבים דינמיים נוספים, כולל דיפוזיה ליפוזומלית ודינמיקה תוך-ממדית. לקבלת פ…

Discussion

NSE היא טכניקה רבת עוצמה וייחודית במדידת דינמיקה מסוסקופית של ממברנות שומנים בדם בתנאים שונים. הניצול היעיל של NSE תלוי באיכות המדגם, בניגודיות הנויטרונים ובמגוון הדינמיקה הנגישת שניתן לבדוק עבור מדגם נתון. לכן, נדרשים מספר צעדים קריטיים לביצוע ניסויי NSE מוצלחים ואיסוף נתונים באיכות גבוהה. ?…

Materials

Chloroform (biotech grade)	Sigma Aldrich	496189	Biotech. grade, ≥99.8%, contains 0.5-1.0% ethanol as stabilizer
Circulating water bath	Julabo	SE-12	Heating Circulator with smart pump, programmable temperature settings, and external sensor connection for measurement and control
Deuterium Oxide	Cambridge Isotopes Laboratories	DLM-4	Deuterated water; Heavy water (D2O) (D, 99.9%)
Digital Semi-Microbalance	Mettler Toledo	MS105	Semi-micro balance with 120 g capacity, 0.01 mg readability, high resolution weighing cell, ergonomic doors, and pipette-check application
Ethanol (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	E7023	200 proof ethanol for molecular biology applications
Glass Pipets	VWR	36360-536	Disposable Soda Lime glass Pasteur pipets
Glass Vials	Thermo Scientific	B7990-1	Borosilicate glass vials with PTFE/Silione septum caps
Lab grade freezer	Fisher Scientific	IU2886D	Ultra-low temprature freezer (-86 to -50 C) for long-term storage of lipids and proteins
Lipids (protaited or perdeuterated)	Avanti Polar Lipids	varies by lipid	Lipids can be purchased from Avanti in powder form or in a chloroform solution with the required amounts and deuteration schemes.
Millipore water purifier	Millipore Sigma	ZRQSVP3US	Direct-Q® 3 UV Water Purification System which deliver both pure and ultrapure water with a built-in UV lamp to reduce the levels of organics for biological  applications
Mini Extruder Set	Avanti Polar Lipids	610020	Mini-extruder set includes mini-extruder, heating block, 2 GasTight Syringes, and 2 O-rings, Polycarbonate Membranes, and Filter Supports
Quick Connect Fittings	Grainger	2YDA1 and 2YDA7	Push-button tube fittings for QuickConnect water circulation applications, e.g. high temperature vesicle extrusion
Syringe Pump	SyringePump.com	New Era-1000	Fully programmable syringe pump for infusion and withdrawal; programs up to 41 pumping phases with adjustable pumping rates, dispensed volumes, and extrusion cycles
Ultrasonic bath	Fisher Scientific	CPX2800	Temperature controlled ultra sonic bath with programmable functionality for degassing and ultrasonic applications
Vacuum Oven	Thermo Scientific	3608	0.7 cu ft vaccum oven with built-in-high-limit thermostat guards against overheating
Vortex Mixer	Fisher Scientific	02-215-414	Variable speed, analog control that allows low rpm start-up for gentle shaking or high-speed mixing for vigorous vortexing of samples