Подход с потерей функции в сетчатке эмбриона цыпленка с использованием транспозон-опосредованной тол2-транспозон-опосредованной экспрессии искусственных микроРНК
Summary
Мы разработали новый подход к потере функции, который включает в себя введение и геномную интеграцию искусственных последовательностей микро-РНК в эмбрионы цыплят с использованием внутрияйцевой электропорации и транспозонной системы Tol2. Этот метод обеспечивает надежную и стабильную методологию нокдауна генов для изучения функции генов во время развития.
Abstract
Сетчатка цыпленка долгое время была важной модельной системой в нейробиологии развития, обладая такими преимуществами, как ее большой размер, быстрое развитие и доступность для визуализации и экспериментальных манипуляций. Тем не менее, его основным техническим ограничением было отсутствие надежных подходов к анализу функций генов. Этот протокол описывает методологию подавления экспрессии генов в развивающейся сетчатке цыпленка, которая включает трансгенную экспрессию искусственных микроРНК (микроРНК) с использованием системы транспозонов Tol2. В этом подходе плазмида транспозона Tol2, содержащая кассету для экспрессии маркера EmGFP (изумрудно-зеленый флуоресцентный белок) и искусственные последовательности пре-микроРНК против гена-мишени, вводится в сетчатку эмбриона цыпленка с конструкцией экспрессии транспозазы Tol2 путем электропорации in ovo . В трансфицированных клетках сетчатки транспозаза катализирует эксцизию экспрессионной кассеты из транспозонного вектора и ее интеграцию в хромосомы хозяина, что приводит к стабильной экспрессии микроРНК и белка EmGFP. В нашем предыдущем исследовании мы продемонстрировали, что экспрессия Nel, гликопротеина, который выполняет несколько функций в развитии нервной системы, может быть значительно подавлена в развивающейся сетчатке цыпленка с помощью этого метода. Наши результаты показывают, что эта методология индуцирует стабильное и надежное подавление экспрессии генов и, таким образом, обеспечивает эффективный подход к потере функции для исследований развития сетчатки.
Introduction
Сетчатка позвоночных является важной модельной системой для изучения развития нервной системы. Несмотря на периферическое расположение, сетчатка анатомически и эволюционно является продолжением центральной нервной системы, а зрительный нерв, состоящий из аксонов ганглиозных клеток сетчатки, представляет собой тракт в центральной нервной системе. Сетчатка цыпленка имеет существенные преимущества в качестве модельной системы для изучения молекулярного механизма развития нервов: она крупная и быстро развивается; она имеет структурное и функциональное сходство с сетчаткой человека; Он легко доступен для визуализации и экспериментальных манипуляций. Молекулярные механизмы пролиферации и дифференцировки клеток, морфогенеза и управления аксонами во время развития нейронов были широко изучены с использованием сетчатки курицы.
Электропорация in ovo успешно используется в течение последних двух десятилетий для введения эктопических генов в клетки развивающегося эмбриона цыпленка. Этот метод позволяет мечить развивающиеся клетки, отслеживать судьбу клеток, отслеживать миграцию клеток и тракты аксонов, а также экспрессию эктопических генов для анализа функции генов in vivo. Хорошо установлены условия in ovo электропорации для эффективной экспрессии эктопических генов в куриных эмбрионах 1,2,3.
Несмотря на эти преимущества, отсутствие стабильного метода потери функции для изучения функции генов было основным техническим ограничением эмбриона цыпленка. В то время как эмбрионы цыплят, электропорированные малыми интерферирующими РНК (миРНК)4 или векторами экспрессии для коротких шпильчатых РНК (шРНК)5, демонстрируют нокдаун гена-мишени, подавление генов в этих подходах является временным, поскольку эффекты исчезают, как только клетки теряют введенные РНК или ДНК. Более стабильная подавление генов может быть достигнута путем доставки миРНК в эмбрионы цыплят с помощью ретровируснойсистемы RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) с длинным терминальным повтором (LTR) с акцептором S-plice). Вирусный вектор встраивается в геном хозяина, и эктопические гены стабильно экспрессируются. Тем не менее, ретровирус может интегрироваться в геном делящихся клеток только во время митотической (М) фазы клеточного цикла, что может наложить ограничения на стадии развития и/или типы клеток, для которых может быть применен этот подход с потерей функции. Кроме того, экспрессия трансгенов RCAS оказывается более медленной и менее устойчивой, чем экспрессия, индуцированная in ovo electroporation7.
Транспозоны — это генетические элементы, которые перемещаются из одного места генома в другое. Элемент Tol2 является членом семейства транспозируемых элементов hAT и содержит внутренний ген, кодирующий транспозазу, которая катализирует транспозонную реакцию элемента Tol28. Когда плазмидный вектор, несущий кассету экспрессии гена, окруженную последовательностями левого и правого концов элементов Tol2 (200.н. и 150.н., соответственно), вводится в клетки позвоночных с конструкцией экспрессии транспозазы Tol2, экспрессионная кассета вырезается из плазмиды и интегрируется в геном хозяина, что поддерживает стабильную экспрессию эктопического гена (рис.). Было показано, что транспозируемый элемент Tol2 может очень эффективно индуцировать транспозицию генов у различных видов позвоночных, включая рыбок данио-рерио9,10, лягушек 11, цыплят 12 и мышей 13, и, таким образом, является полезным методом трансгенеза и инсерционного мутагенеза. Транспозонная система Tol2 была успешно использована для условного нокдауна гена-мишени путем геномной интеграции миРНК, обработанной из длинной двухцепочечной РНК14.
Этот протокол описывает подход с потерей функции у эмбриона цыпленка, который включает введение искусственных микроРНК (микроРНК) с помощью транспозонной системы Tol215,16. В этом подходе экспрессионная кассета для маркера EmGFP (изумрудно-зеленый флуоресцентный белок) и искусственных микроРНК против гена-мишени клонируется в транспозонный вектор Tol2. Затем транспозонная конструкция Tol2 вводится в эмбриональную сетчатку цыпленка с конструкцией экспрессии Tol2 транспозазы путем электропорации in ovo. В трансфицированных клетках сетчатки транспозаза катализирует эксцизию экспрессионной кассеты из транспозонного вектора и ее интеграцию в хромосомы хозяина, что приводит к стабильной экспрессии микроРНК и белка EmGFP. В наших предыдущих исследованиях мы успешно сбивали экспрессию Nel, внеклеточного гликопротеина, преимущественно экспрессируемого в нервной системе, в развивающейся сетчатке цыпленка (см. Репрезентативные результаты). Наши результаты показывают, что стабильная и эффективная подавление генов может быть достигнута in ovo с помощью этого метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол представляет собой подробное руководство по подавлению экспрессии генов в развивающейся сетчатке цыпленка путем трансгенной экспрессии искусственных микроРНК с использованием овоэлектропорации и системы транспозонов Tol2.
Следующие факторы имеют р?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Векторы pT2K-CAGGS и pCAGGS-T2TP были любезно предоставлены Йошико Такахаси (Киотский университет, Киото, Япония) и Коити Каваками (Национальный институт генетики, Мисима, Япония) соответственно. Мы благодарим Михаэля Бербероглу за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантами Королевского общества и Исследовательского совета по биотехнологии и биологическим наукам (BBSRC) (Великобритания).
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer’s activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Biologie du développement. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Génétique. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. . iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021)
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
