Tap-av-funksjon tilnærming i den embryonale Chick Retina ved bruk av Tol2 transposonmediert transgen ekspresjon av kunstige mikroRNA
Summary
Vi har utviklet en ny tap-av-funksjon-tilnærming som involverer introduksjon og genomisk integrering av kunstige mikro-RNA-sekvenser i kyllingembryoer ved bruk i ovo-elektroporering og Tol2-transposonsystemet. Denne teknikken gir en robust og stabil genknockdown-metodikk for studier av genfunksjon under utvikling.
Abstract
Chick retina har lenge vært et viktig modellsystem i utviklingsnevrobiologi, med fordeler som inkluderer sin store størrelse, raske utvikling og tilgjengelighet for visualisering og eksperimentelle manipulasjoner. Den største tekniske begrensningen hadde imidlertid vært mangelen på robuste tap-av-funksjon-tilnærminger for genfunksjonsanalyser. Denne protokollen beskriver en metodikk for geninaktivering i den utviklende kyllingnetthinnen som involverer transgen ekspresjon av kunstige mikroRNA (miRNA) ved bruk av Tol2-transposonsystemet. I denne tilnærmingen blir et Tol2-transposonplasmid som inneholder en ekspresjonskassett for EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige pre-miRNA-sekvenser mot et målgen introdusert i den embryonale kyllingnetthinnen med en Tol2-transposaseuttrykkskonstruksjon ved i ovo-elektroporering . I de transfekterte retinale cellene katalyserer transposasen eksisjonen av ekspresjonskassetten fra transposonvektoren og dens integrasjon i vertskromosomer, noe som fører til stabilt uttrykk for miRNA og EmGFP-proteinet. I vår tidligere studie har vi vist at uttrykket av Nel, et glykoprotein som utøver flere funksjoner i nevral utvikling, kan undertrykkes betydelig i den utviklende kyllingnetthinnen ved å bruke denne teknikken. Våre resultater indikerer at denne metodikken induserer en stabil og robust undertrykkelse av genuttrykk og dermed gir en effektiv tap-av-funksjon-tilnærming for studier av netthinneutvikling.
Introduction
Virveldyrets netthinne er et viktig modellsystem for å studere nevral utvikling. Til tross for sin perifere plassering er netthinnen anatomisk og utviklingsmessig en forlengelse av sentralnervesystemet, og optisk nerve, som består av axoner av retinale ganglionceller, representerer en kanal i sentralnervesystemet. Chick retina har betydelige fordeler som et modellsystem for å studere den molekylære mekanismen for nevral utvikling: Den er stor og utvikler seg raskt; den har strukturelle og funksjonelle likheter med den menneskelige netthinnen; Det er svært tilgjengelig for visualisering og eksperimentelle manipulasjoner. Molekylære mekanismer for celleproliferasjon og differensiering, morfogenese og aksonveiledning under nevral utvikling har blitt grundig studert ved bruk av kyllingnetthinnen.
I ovo har elektroporering blitt brukt i løpet av de siste to tiårene for å introdusere ektopiske gener i celler i det utviklende kyllingembryoet. Denne teknikken tillater merking av utviklingsceller, sporing av celleskjebne og sporing av cellemigrasjon og aksonkanaler, samt ektopisk genuttrykk for in vivo-analyse av genfunksjon. Betingelsene for in ovo elektroporering for effektiv ektopisk genekspresjon i kyllingembryoer har vært godt etablert 1,2,3.
Til tross for disse fordelene hadde mangelen på en stabil tap-av-funksjon-teknikk for studier av genfunksjon vært en stor teknisk begrensning for kyllingembryoet. Mens kyllingembryoer elektroporert med små forstyrrende RNA (siRNAer)4 eller ekspresjonsvektorer for korte hårnåls-RNA (shRNA)5 viser nedslag av det målrettede genet, er genundertrykkelse i disse tilnærmingene forbigående fordi effektene forsvinner når cellene mister de introduserte RNAene eller DNAene. En mer stabil genundertrykkelse kan oppnås ved å levere siRNA til kyllingembryoer ved hjelp av et RCAS (R-eplikasjon Competent Avian sarkom-leukosevirus (ASLV) long terminal repeat (LTR) med en Splice acceptor) retrovirussystem 6. Den virale vektoren integreres i vertsgenomet, og ektopiske gener uttrykkes stabilt. Imidlertid kan retroviruset bare integreres i genomet av delende celler under den mitotiske (M) fasen av cellesyklusen, noe som kan pålegge en begrensning på utviklingsstadiene og / eller celletypene som denne tap-av-funksjon-tilnærmingen kan brukes på. I tillegg virker ekspresjon av transgener av RCAS langsommere og mindre robust enn det som induseres av i ovo elektroporering7.
Transposoner er genetiske elementer som beveger seg fra ett sted på genomet til et annet. Tol2-elementet er medlem av hAT-transponerbar elementfamilie og inneholder et internt gen som koder for en transposase som katalyserer transposonreaksjonen til Tol2-elementet8. Når en plasmidvektor som bærer en genuttrykkskassett flankert av sekvensene av venstre og høyre ende av Tol2-elementene (henholdsvis 200 bp og 150 bp) blir introdusert i virveldyrceller med en Tol2-transposaseekspresjonskonstruksjon, blir ekspresjonskassetten skåret ut fra plasmidet og integrert i vertsgenomet, som støtter et stabilt uttrykk av ektopisk gen (figur 1). Det har vist seg at det transponerbare elementet Tol2 kan indusere gentransposisjon svært effektivt hos forskjellige virveldyrarter, inkludert sebrafisk9,10, frosker 11, kyllinger 12 og mus 13, og er dermed en nyttig metode for transgenese og innsettingsmutagenese. Tol2-transposonsystemet har blitt brukt til betinget knockdown av et målgen ved genomisk integrasjon av siRNA som behandles fra langt dobbeltstrenget RNA14.
Denne protokollen beskriver en tap-av-funksjon-tilnærming i kyllingembryoet som involverer innføring av kunstige mikroRNA (miRNA) av Tol2-transposonsystemet15,16. I denne tilnærmingen klones en ekspresjonskassett for EmGFP-markøren (smaragdgrønt fluorescerende protein) og kunstige miRNA mot et målgen til en Tol2-transposonvektor. Tol2 transposon-konstruksjonen blir deretter introdusert i den embryonale chick retina med en Tol2 transposase ekspresjonskonstruksjon ved i ovo elektroporering. I de transfekterte retinale cellene katalyserer transposasen eksisjonen av ekspresjonskassetten fra transposonvektoren og dens integrasjon i vertskromosomer, noe som fører til stabilt uttrykk for miRNA og EmGFP-proteinet. I våre tidligere studier slo vi vellykket ned uttrykket av Nel, et ekstracellulært glykoprotein hovedsakelig uttrykt i nervesystemet, i den utviklende kyllingretina (se representative resultater). Våre resultater tyder på at stabil og effektiv gensuppresjon kan oppnås i ovo ved denne teknikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen gir en detaljert veiledning til geninaktivering i den utviklende kyllingnetthinnen ved transgen ekspresjon av kunstige miRNA ved bruk av ovo-elektroporering og Tol2-transposonsystemet.
Følgende faktorer er av avgjørende betydning for å utføre denne teknikken vellykket. For det første er det kritisk å bruke miRNA-sekvenser som er bekreftet for å utøve robuste knockdown-effekter. Før du bruker dem til ovo-elektroporering, test individuelle pre-miRNA-…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pT2K-CAGGS- og pCAGGS-T2TP-vektorene ble levert av henholdsvis Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Kyoto, Japan) og Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Mishima, Japan). Vi takker Michael Berberoglu for hans avgjørende lesning av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Royal Society and Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (UK) til M.N.
Materials
| 18 G needle, 2" | VWR | 89219-320 | |
| AP-TAG kit A and AP-TAG kit B | GenHunter Corp | Q201 and Q202 | Plasmid vectors for making AP fusion proteins (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html) |
| Block-iT RNAi Designer | Invitrogen | An online tool to choose target sequences and design pre-miRNA sequences (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/) | |
| BSA 10 mg | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| C115CB cables | Sonidel | C115CB | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254 |
| C117 cables | Sonidel | C117 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 |
| Capillary tubes with omega dot fiber (Micropipette needles) | FHC | 30-30-1 | 1 mm O.D. 0.75 mm I.D |
| CUY21 square wave electroporator | Nepa Gene | CUY21 | |
| Diethanolamine (pH 9.8) | Sigma-Aldrich | D8885 | |
| Dissecting microscope | |||
| Egg incubator | Kurl | B-Lab-600-110 | https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html |
| Electrode holder | Sonidel | CUY580 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85 |
| Electrodes | Nepa Gene | CUY611P3-1 | https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94 |
| Electromax DH10B | Invitrogen | 18290-015 | Electrocompetent E. coli cells |
| Fast green FCF | Sigma-Aldrich | F7258 | |
| Fertilized chicken eggs (Gallus gallus) | Obtained from commercial vendors (e.g. Charles River) or local farmers | ||
| Gooseneck fiber light source | |||
| FuGene 6 transfection reagent | Promega | E2691 | |
| Hamilton syringe (50 μL) | Sigma-Aldrich | 20715 | Hamilton Cat No 80901 |
| Hanks' balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760 | |
| HEPES | GIBCO | 15630080 | |
| L-Homoarginine | Sigma-Aldrich | H10007 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 13112 | |
| Micromanipulator | Narishige (Japan) | MM3 | http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html |
| Micropipette puller | Shutter Instrument | P97 | |
| p-Nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich | 20-106 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| pCAGGS-T2TP vector | Tol2 transposase expression plasmid. A generous kind gift of Koichi Kawakami (National Institute of Genetics, Japan). Also available from Addgene. | ||
| Pfu | ThermoFisher | F566S | |
| Picospritzer (Optional) | Parker | Pressure microinjection system | |
| Plasmid maxi kit | Qiagen | 12163 | Plasmid maxiprep kit |
| pT2K-CAGGS vector | Tol2 transposon vector. Kindly provided by Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan) | ||
| PVC tubing | VWR (UK) | 228-3830 | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | S9007-5 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP | Invitrogen | K493600 | Contains the miRNA expression vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), a control vector (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), accessory reagents, and instructions (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00) |
| Thermal cycler |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
- Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer’s activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
- Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
- Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
- Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2 (2006).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
- Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Biologie du développement. 2 (2), 616-624 (2007).
- Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Génétique. 166 (2), 895-899 (2004).
- Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
- Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
- Nakamoto, M., Nakamoto, C., Mao, C. -. A. . iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. 8, 91-108 (2020).
- BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021)
- Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
- Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
- Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
- Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
- Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
- Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).
