Anvendelse av ultralyd og skjærbølge elastografiavbildning i en rottemodell av NAFLD/NASH

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av en forbedret ultralydteknikk for ikke-invasivt observere og kvantifisere levervevsendringer i gnagermodeller av ikke-alkoholholdig fettleversykdom.

Abstract

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) er en tilstand innenfor spekteret av alkoholfri fettleversykdom (NAFLD), som er preget av leverfettakkumulering (steatose) og betennelse som fører til fibrose. Prekliniske modeller som nøye recapitulerer human NASH/NAFLD er avgjørende for narkotikautviklingen. Mens leverbiopsi for tiden er gullstandarden for måling av NAFLD/ NASH-progresjon og diagnose i klinikken, i det prekliniske rommet, er det nødvendig med enten innsamling av hele leverprøver på flere tidspunkter under en studie eller biopsi av leveren for histologisk analyse for å vurdere sykdomsstadiet.

Å gjennomføre en leverbiopsi midt i studien er en invasiv og arbeidsintensiv prosedyre, og innsamling av leverprøver for å vurdere sykdomsnivå øker antall forskningsdyr som trengs for en studie. Dermed er det behov for en pålitelig, overførbar, ikke-invasiv bildebiomarkør for å oppdage NASH / NAFLD i disse prekliniske modellene. Ikke-invasive ultralydbaserte B-modusbilder og Shear Wave Elastography (SWE) kan brukes til å måle steatose samt leverfibrose. For å vurdere nytten av SWE i prekliniske gnagermodeller av NASH, ble dyr plassert på et pro-NASH-kosthold og gjennomgikk ikke-invasiv ultralyd B-modus og skjærbølgeelastografiavbildning for å måle hepatoral (HR) indeks og leverelastisitet, og målte progresjon av henholdsvis leverfettakkumulering og vevsstivhet, på flere tidspunkter i løpet av en gitt NAFLD / NASH-studie.

HR-indeksen og elastisitetstallene ble sammenlignet med histologiske markører av steatose og fibrose. Resultatene viste sterk sammenheng mellom HR-indeksen og prosentandelen av oljerød O (ORO) farging, samt mellom elastisitet og Picro-Sirius Rød (PSR) farging av leveren. Den sterke sammenhengen mellom klassiske ex vivo-metoder og in vivo-bilderesultater gir bevis på at skjærbølgeelastografi/ultralydbasert avbildning kan brukes til å vurdere sykdomsfenotype og progresjon i en preklinisk modell av NAFLD/NASH.

Introduction

Alkoholfri fettleversykdom (NAFLD) er en metabolsk tilstand preget av overdreven opphopning av fett i leveren og blir raskt en ledende leversykdom over hele verden med en nylig rapportert global prevalens på 25%¹. Alkoholfri steatohepatitt (NASH) er et mer utviklet stadium av NAFLD-spekteret, preget av overflødig leverfett med progressiv cellulær skade, betennelse og fibrose. Disse plagene er ofte stille, uoppdaget via blodprøver eller rutinemessige undersøkelser, til det allerede har oppstått betydelig skade på pasientens lever. For tiden er gullstandarden for å diagnostisere NASH hos pasienter gjennom histologisk undersøkelse av pasientavledede leverbiopsiprøver. På samme måte er prekliniske forskere som arbeider for å forstå patogenesen til NASH /NAFLD, samt legemiddelutviklingsindustrien, avhengige av in vivo kilebiopsi av leverprøver eller terminal eutanasi av satellittkohorter for histologi for å måle steatose, betennelse og fibrose.

For eksempel har leverkilebiopsi vært en standard teknikk for å vurdere steatohepatitt og fibrose mens du bruker GUBRA NASH-modellen². Leveren kile biopsi metoden er invasiv og arbeidskrevende hos små dyr³. Bruken av kileleverbiopsi midt i en studie representerer en ekstra eksperimentell variabel i en sykdomsmodell, noe som ofte øker antall dyr som trengs. Med disse faktorene i tankene viser ikke-invasive avbildningsteknikker som kan brukes til pålitelig vurdering av steatose og fibrose i NASH / NAFLD dyremodeller på tidlige tidspunkter, verdifulle. Skjærbølgeelastografi (SWE) er en ultralydbasert metode som brukes til å måle elastisiteten til bløtvev. Teknikken måler forplantning av skjærbølger skapt av supersoniske ultralydpulser rettet mot et vevsmål, og beregner deretter en verdi som heter E modulus⁴. Hastigheten på skjærbølgen er proporsjonal med graden av vevstivhet.

Figur 1 og figur 2 viser oppsettet av bildeområdet og SWE-instrumentet. SWE-instrumentet er en enkelt, hjulenhet med to skjermer og et kontrollpanel vist i figur 2A. Den øvre skjermen (figur 2B) fungerer som dataskjerm og viser bilder og pasientkataloger. Kontrollpanelet (Figur 2C) er en rekke knapper og ringer som styrer generelle aspekter ved bildeopptak: frysing av skjerm, lagring av bilder, endring fra en modus til en annen. Den nedre skjermen (Figur 2D) er en berøringsskjerm med tilleggskontroller for å endre innstillinger og fungerer som et tastatur for å legge inn data etter behov. Instrumentet er utstyrt med en pekepenn som kan brukes på berøringsskjermen om ønskelig. Ultralydprober festes til enhetens nedre frontpanel. For B-modus og SWE-avbildning hos gnagere ble den supers lineære 6 til 20 MHz-svingeren brukt. Denne evnen til ikke-invasivt å måle vevsstivhet gjør SWE til et verdifullt verktøy for identifisering og iscenesettelse av leverfibrose⁵ hos NASH-pasienter, noe som reduserer behovet for mer invasive metoder. SWE har faktisk blitt brukt til å måle leverfibrose hos pasienter og er en FDA-godkjent metode for å score fibrose i klinikken⁶. Å bruke SWE til å overvåke NASH-progresjon i dyremodeller av sykdommen ville gi et oversettelsesverktøy for utvikling av behandlinger og samtidig forbedre dyrevelferden gjennom reduksjon av dyrepersonstall og raffinering av in vivo-prosedyrer for å minimere smerte og nød.

SWE-avbildning hos menneskelige pasienter bruker en lavfrekvent ultralydtransduser⁴, som ikke er ideell for små dyr. Spesielt har høyfrekvente SWE-teknikker blitt brukt til å evaluere effekten av acetyl-CoA karboksylaseinhibering på patogenese av NASH i en rottemodell⁷, og nytten av denne teknikken er beskrevet i karbontetraklorid rottemodeller av leverfibrose med vellykkede resultater sammenlignet med tradisjonelle METAVIR histologiske skåringsmetoder⁸. Eksisterende litteratur mangler imidlertid detaljert teknikk- og metodeinformasjon om anvendelsen av SWE-avbildning i prekliniske modeller av NASH. Som beskrevet ovenfor er leversteatose en av hovedtrekkene i NAFLD / NASH-tilstanden og er et viktig stadium der intervensjon kan vurderes. Dermed er vurdering av leverfettakkumulering ved hjelp av en avbildningsmodalitet like viktig som å vurdere leverfibrose i prekliniske modeller av NASH / NAFLD.

En ultralydteknikk kjent som HR-indeksen, et forhold mellom vevslysstyrke i leveren sammenlignet med nyrebarken, har blitt brukt som surrogatmarkør for steatose i klinikken^9,10. Denne tilnærmingen har imidlertid ikke blitt mye brukt i prekliniske dyremodeller av NAFLD/NASH. Denne artikkelen beskriver en metode for måling av elastisitet samt HR-indeksen som surrogatmarkør for henholdsvis leverfibrose og steatose i en kolinmangel, fettfattig diett (CDAHFD) rottemodell av NAFLD/NASH. Denne modellen induserer rask steatose, leverbetennelse og fibrose, som er målbar innen 6 uker hos mus¹¹. Tilsetningen av kolesterol (1%) til denne dietten har vist seg å fremme fibrogenese hos rotter¹², noe som gjør denne modellen til en passende kandidat for valideringsstudier som involverer skjærbølgeavbildning. Samlet sett kan denne bildeteknologien også brukes på et bredt spekter av NASH-modeller / dietter der steatose og / eller fibrose er et endepunkt av interesse.

Protocol

Alle dyrerelaterte prosedyrer ble gjennomgått og godkjent av Pfizer’s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og gjennomført i et AAALAC (Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) International akkreditert anlegg. 1. Sykdomsinduksjon Bruk mannlige Wister Han rotter (150-175 g; ~ 6-7 uker gammel; totalt 40 rotter) som er fri for kjente rotte adventitial patogener. Hus rottene i par i individuelt ventilert caging med papir sengetøy (se materialtabel…

Representative Results

Et kjennetegn på dyr matet CDAHFD er steatose. Akkumulering av fett i leveren endrer vevets ekkogene egenskaper, som kan kvantifiseres ved å måle leverens lysstyrke og normalisere den til lysstyrken til nyrebarken fra et B-modusbilde tatt i samme plan. Den kvantifiserte verdien uttrykkes som en HR-indeks, som er et indirekte mål på steatose. I figur 4Aviser et representativt leverbilde fra et kontrolldyr omtrent lik eller mindre lysstyrke (ekkogenisitet) sammenlignet med nyrebarken. Der…

Discussion

Ultralydbasert avbildning, inkludert SWE, kan være et uvurderlig verktøy for langsgående vurdering av leversteatose og stivhet i prekliniske modeller av NAFLD/NASH. Dette dokumentet beskriver detaljerte metoder for hvordan du skaffer deg B-modus av høy kvalitet, samt SWE-bilder av lever for måling av HR-indeksen og elastisitet ved hjelp av en CDAHFD-diettindusert rottemodell av NASH. Videre viser resultatene utmerket korrelasjon mellom HR-indeksen og elastisiteten med gullstandarden for evaluering-histologisk vurder…

Materials

Aixplorer	Supersonic Imagine		Shear Wave Elastography Instrument
Aixplorer SuperLinear SLH20-6 Transducer	Supersonic Imagine		Transducer for Shear Wave Elastography
Alpha-dri bedding			rat cages
Aperio AT2 scanner	Leica Biosystems		Digital Pathology Brightfield Scanner
Compac 6 Anesthesia System	VetEquip		Anesthesia Vaporizer and Delivery System. Any anesthesia delivery system can be used, however.
Manage Imager Database	Leica Biosystems		Digital Pathology
Mayer's Hematoxilin	Dako/Agilent		H&E Staining/Histology
Nair	Church & Dwight		Hair remover
Oil Red O solution	Poly Scientific		Lipid Staining/Histology
Picrosirius Red Stain (PSR)	Rowley Biochemical	F-357-2	Collagen Stain/Histology
Puralube Opthalmic ointment	Dechra Veterinary Product		Lubricatn to prevent eye dryness  during anesthesia
Tissue-Tek Prisma Plus	Sakura Finetek USA		Automated slide stainer
VISIOPHARM software	Visiopharm		Digital pathology software
	Research Diets	A06071309i	NASH inducing diet
	Purina	5053	Control animal chow
Wistar Han rats	Charles River Laboratories