Menneskelige nyre tubuloid kulturer repræsenterer en værdifuld in vitro model til at studere nyrefysiologi og sygdom. Tubuloider kan etableres fra nyrevæv (sund og syg) samt urin, sidstnævnte repræsenterer en let opnåelig og mindre invasiv kilde til forskningsmateriale.
Voksne stamcelle (ASC)-afledte menneskelige nyre epitelorganoider, eller tubuloider, kan etableres fra sunde og syge nyre epitel med høj effektivitet. Normale nyre tubuloider rekapitulere mange aspekter af deres væv af oprindelse. De repræsenterer forskellige nephron segmenter – især af den proksimale tubule, loop af Henle, distale tubules, og indsamling kanal – og kan bruges til at studere normal nyre fysiologi. Desuden letter tubuloidteknologi sygdomsmodellering, f.eks.for infektionssygdomme såvel som for kræft. Opnåelse af nyre epitelceller til tubuloid generation er imidlertid afhængig af rester kirurgisk materiale (såsom delvise) nefrectomies) eller nål biopsier. Evnen til at dyrke tubuloider fra urin ville give en alternativ, mindre invasiv kilde til sunde nyre epitelceller. Det har tidligere vist sig, at tubuloid kulturer med succes kan genereres fra kun et par milliliter frisk indsamlet urin. Denne artikel beskriver protokollerne til at generere og udbrede ASC-afledte menneskelige nyre tubuloid kulturer fra væv og urinprøver.
Nyrer udføre funktionen af systemisk at kontrollere balancen af kropsvæsker. Svækkelsen af deres fysiologiske funktion kan være forårsaget af forskellige faktorer, herunder diabetes, forhøjet blodtryk og lægemiddelinducerettoksicitet 1. For en bedre forståelse af normal nyrefysiologi samt udvikling af nyresygdomme er brugen af repræsentative prækliniske modeller afgørende. I de senere år er der genereret flere in vitro nyremodeller baseret på den såkaldte organoidteknologi2. Organoider er tredimensionelle, flercellede strukturer, der ligner morfologien og fysiologien i vævet (normalt eller sygt), hvorfra de stammer. De kan genereres fra pluripotente (PSC’er) eller voksne stamceller (ASCs), hver med deres egne egenskaber og applikationer.
PSC-afledte nyreorganoider efterligner nefrosogenese3,4,5. De kan også etableres fra patient-afledte engagerede celler ved tvungen dedifferentiation (induceret pluripotency eller iPSC). iPSC’er kan efterfølgende differentieres i de forskellige celletyper af nephron, den funktionelle enhed af nyrerne, ved rettidig eksponering for specifikke vækstfaktor cocktails. Mens skabe en temmelig komplet mini-organ i en skål, deres etablering forbliver tidskrævende, og på grund af omprogrammering protokol, iPSCs kan være modtagelige for uønsket genetisk ustabilitet6. Desuden er iPSC-organoider ikke i stand til fuldt ud at modnes til voksne nyreceller, hvilket afslører en transskriptomprofil, der ligner fosterets nyre på et tidligt udviklingsstadium7.
ASC-afledte menneskelige nyre tubuloider har vist sig at rekapitulere fornyelsen af voksne nyre epitel. De repræsenterer primært den proksimale tubule, loop af Henle, distale tubules og opsamlingskanal, som bekræftet af udtrykket af forskellige transportproteiner8,9,10. Tubuloid kultur protokol giver mulighed for hurtig udvidelse af patient-afledt nyrevæv, samtidig med at et stabilt genom. Forskningsapplikationer omfatter undersøgelse af normal nyrefysiologi, nefrotoksicitet, lægemiddeltest samt sygdomsmodellering8,10,11,12. En potentiel begrænsning af etableringen af patient-afledte organoid kulturer, herunder tubuloider, er tilgængeligheden af frisk væv. Men flere rapporter har vist, at urin kan tjene som en kilde til nyre epitelceller, hvilket giver en meget enklere, mindre invasiv strategi for at opnå patientmateriale til tubuloid kulturer8,13,14. Faktisk har det for nylig vist sig, at tubuloider kan dyrkes fra urin8. Denne artikel beskriver etablering og vedligeholdelse af tubuloid kulturer fra nyrevæv og urin.
Organoider betragtes som avatarer af det væv, hvorfra de er afledt. De giver mulighed for hurtig udvidelse af patientmateriale, samtidig med at de genotypice og fænotypiske egenskaber ved oprindelsesvævet15bevares . Organoid teknologi har for nylig åbnet dørene for udvikling af mere repræsentative prækliniske modeller, som kan bruges som vigtige værktøjer til at oversætte resultater fra bænken til sengen. Nyre tubuloider er lovende in vitro modeller til test af narkotika-induceret nefrotoksicitet, en almindelig bivirkning af mange kemoterapi medicin2,8,12. Som sådan, patient-afledt tumor organoid kulturer blev påvist at være prædiktiv for patientens reaktion på behandling16,17,18. Test af lægemidler på en high-throughput måde på tubuloider derfor potentielt giver mulighed for bedre definition af terapeutiske vinduer og mindsker risikoen for lægemiddel-induceret nefrotoksicitet hos patienter.
Almindeligt anvendte antibiotika er blevet beskrevet for at udøve en toksisk effekt på nyrerne19. Selv om tilstedeværelsen af bredspektret antibiotika er nødvendig for en vellykket etablering af kulturerne ved at forhindre forurening, er det vigtigt at overveje deres potentielle nefrotoksicitet. Selv om der ikke er observeret negative virkninger af antibiotika på etableringen af tubuloidkulturer, er der behov for yderligere undersøgelser for at evaluere deres virkninger grundigt. Tubuloider kan udnyttes til at studere og modellere sygdomme8. Ciliopatier (patologisk dysfunktion af cilier) samt andre genetiske syndromer, der påvirker nyrerne, kan studeres ved enten at generere tubuloidlinjer direkte fra berørte forsøgspersoner eller ved at bruge sunde kulturer, hvor sygdomsspecifikke drivermutationer kan introduceres via CRISPR /Cas9-genomredigering20.
Selvom tubuloider er flercellede nyrekulturer, mangler de flere nyrecelletyper, herunder podocytter og endotelceller8. Desuden, i modsætning til nogle andre ASC-afledte organoid modeller, tubuloider har et begrænset replikativt potentiale, da de kan dyrkes for ca 15 passager. Denne begrænsede levetid kan dog forlænges betydeligt ved tilsætning af Wnt til kulturmediet21. Yderligere optimering af tubuloid kultur protokol er nødvendig for at gøre dem endnu mere repræsentative for nyrerne, herunder mere differentierede celletyper. Selv om effektiviteten af tubuloid etablering fra vævsprøver er meget høj (>95%), kan det i sjældne tilfælde mislykkes. Der kan være forskellige årsager, herunder: 1) dårlig kvalitet af udgangsmaterialet (f.eks.nekrotisk væv som følge af lægemiddelbehandling), 2) overdtagelse af vævsprøven eller 3) forurening af den primære prøve.
For at sikre, at kvaliteten af de modtagne vævsprøver er tilstrækkelig til at fortsætte med protokollen, er det vigtigt at opretholde tæt kontakt med patologipersonalet, der udfører evalueringen af vævet ved operationen. Hvis der foreligger tilstrækkeligt materiale, skal dets levedygtighed bekræftes ved histologisk undersøgelse(f.eks.hæmatoxylin og eosinfarvning). For at forhindre celle lysis under enzymatisk fordøjelse er det desuden vigtigt, at inkubationsproceduren ikke er længere end 1 time. Endelig bør der for at forhindre forurening tilsættes antibiotika og svampedræbende midler til vaske- og kulturmedierne.
Urin kan indeholde eksfolierede epitelceller, der ikke er afledt afnyrerne 22, som kan forurene tubuloidkulturerne. Disse omfatter for eksempel urotelceller, der i modsætning til nyredekniske celler er positive for tumorprotein P63 og negative for PAX88. Det anbefales derfor at teste kulturerne for PAX8-positivitet for at bekræfte renheden af etablerede nyre tubuloidlinjer, før man fortsætter med opfølgende forsøg (Figur 4B).
Urin repræsenterer et fjendtligt miljø for celler på grund af højt osmotisk tryk og lav pH. Det er derfor afgørende for protokollens succes, at prøverne behandles så hurtigt som muligt ved urinindsamling. Som sådan bør den indsamlede urin fortyndes og vaskes grundigt med bufferopløsning så hurtigt som muligt for at sikre tilstedeværelsen af levedygtige celler på tidspunktet for såning. Succesraten for tubuloid etablering vil falde betydeligt, hvis urinen opbevares i flere timer før forarbejdning. Endelig, selvom steril, urin har en høj risiko for forurening forbundet med indsamlingsprocessen. Det er derfor vigtigt at supplere vaske- og vækstmedium med antibiotika og svampedræbende midler. Når man tager højde for alt det ovenstående, kan der opnås en succesrate på ca. 50%.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker alle patienter og deres familier for at deltage i undersøgelsen. Vi takker det kliniske team, der faciliterede vores forskning. Vi er taknemmelige for støtten fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC) starttilskud 850571 (J.D.), Det Nederlandske Kræftsamfund (KWF)/Alpe d’HuZes Bas Mulder Award (nr. 10218, J.D.), Oncode Institute og Foundation Children Cancer Free (KiKa nr. 292, C.C.)
A83-01 | Tocris | 2939/10 | Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
antiPAX8 antibody | LSBio | LS-B13466 | |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Stock of 50x, final concentration of 1x |
BME | Trevigen | 3533-010-02 | |
Collagenase | Sigma Aldrich | C9407 | Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL |
GlutaMAX – L-alanine/L-glutamine | Gibco | 35050061 | Stock of 100x, final concentration of 1x |
Hepes | Gibco | 15630106 | Stock of 1 M, final concentration of 10 mM |
Multiwell tissue culture plates 12 wells | CELLSTAR | 665180 | |
Multiwell tissue culture plates 24 wells | CELLSTAR | 662160 | |
Multiwell tissue culture plates 6 wells | CELLSTAR | 657160 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140163 | Stock of 10.000 U/mL, final concentration of 100 U/mL |
Primocin – broad-range antibiotics | Invivogen | ant-pm-1 | Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL |
Red blood cells lysis buffer | Roche | 11814389001 | |
RhoKinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM |
R-spondin conditioned medium | Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10% | ||
TrypLe Express/ trypsin replacement agent | ThermoFisher Scientific | 12605010 |