मानव गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों गुर्दे शरीर विज्ञान और रोग का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान इन विट्रो मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं। ट्यूबुलॉइड को गुर्दे के ऊतकों (स्वस्थ और रोगग्रस्त) के साथ-साथ मूत्र से स्थापित किया जा सकता है, बाद में अनुसंधान सामग्री के आसानी से प्राप्य और कम आक्रामक स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं।
वयस्क स्टेम सेल (एएससी) -व्युत्पन्न मानव गुर्दे एपिथेलियल ऑर्गेनॉइड, या ट्यूबुलॉइड, उच्च दक्षता के साथ स्वस्थ और रोगग्रस्त गुर्दे एपिथेलियम से स्थापित किया जा सकता है। सामान्य गुर्दे ट्यूबुलॉइड मूल के अपने ऊतकों के कई पहलुओं को फिर से रीकैपिटुलेट करते हैं। वे अलग नेफ्रॉन खंडों का प्रतिनिधित्व करते हैं – सबसे विशेष रूप से समीपस्थ ट्यूबल, हेनले के लूप, डिस्टल ट्यूबल, और डक्ट इकट्ठा करने के लिए – और सामान्य गुर्दे के शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, ट्यूबुलाइड तकनीक रोग मॉडलिंग की सुविधा देती है, उदाहरणके लिए, संक्रामक रोगों के साथ-साथ कैंसर के लिए। ट्यूबुलाइड पीढ़ी के लिए गुर्दे की एपिथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करना, हालांकि, बचे हुए सर्जिकल सामग्री (जैसे आंशिक) नेफ्रेक्टॉमी) या सुई बायोप्सी पर निर्भर है। मूत्र से ट्यूबुलाइड विकसित करने की क्षमता स्वस्थ गुर्दे एपिथेलियल कोशिकाओं का एक विकल्प, कम आक्रामक स्रोत प्रदान करेगी। यह पहले दिखाया गया है कि ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को ताजा एकत्र मूत्र के केवल कुछ मिलीलीटर से सफलतापूर्वक उत्पन्न किया जा सकता है। यह लेख ऊतक और मूत्र के नमूनों से एएससी-व्युत्पन्न मानव गुर्दे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को उत्पन्न करने और प्रचारित करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।
गुर्दे शरीर के तरल पदार्थों के संतुलन को व्यवस्थित रूप से नियंत्रित करने का कार्य करते हैं। उनके शारीरिक कार्य की हानि मधुमेह, उच्च रक्तचाप, और दवा प्रेरित विषाक्तता1सहित विभिन्न कारकों के कारण हो सकती है। सामान्य गुर्दे के शरीर विज्ञान की बेहतर समझ के साथ-साथ गुर्दे की बीमारियों के विकास के लिए, प्रतिनिधि प्रीक्लिनिकल मॉडल का उपयोग महत्वपूर्ण है। हाल के वर्षों में, तथाकथित ऑर्गेनॉइड प्रौद्योगिकी2के आधार पर कई इन विट्रो किडनी मॉडल उत्पन्न किए गए हैं। ऑर्गेनॉइड तीन आयामी, बहुकोशिकीय संरचनाएं हैं जो ऊतक (सामान्य या रोगग्रस्त) के आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान जैसी होती हैं, जिनसे वे उत्पन्न होते हैं। वे pluripotent (PSCs) या वयस्क स्टेम सेल (ASCs) से उत्पन्न किया जा सकता है, प्रत्येक अपनी विशेषताओं और अनुप्रयोगों के साथ ।
पीएससी से व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनॉइड नेफ्रोजेनेसिस3,4,5की नकल करते हैं । उन्हें जबरन डिफरेंटाइजेशन (प्रेरित प्लूपिपेंसी या आईपीएससी) द्वारा रोगी-व्युत्पन्न प्रतिबद्ध कोशिकाओं से भी स्थापित किया जा सकता है। आईपीएससी को बाद में विशिष्ट विकास कारक कॉकटेल के समय पर संपर्क करके नेफ्रॉन के विभिन्न सेल प्रकारों, गुर्दे की कार्यात्मक इकाई में विभेदित किया जा सकता है। एक डिश में एक जगह पूरा मिनी अंग बनाने के दौरान, उनकी स्थापना समय लेने वाली रहती है, और पुनर्प्रोग्रामिंग प्रोटोकॉल के कारण, आईपीएससी अवांछित आनुवंशिक अस्थिरता6के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है। इसके अलावा, आईपीएससी ऑर्गेनॉइड वयस्क गुर्दे की कोशिकाओं में पूरी तरह से परिपक्व होने में सक्षम नहीं हैं, एक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफ़ाइल का खुलासा करते हैं जो प्रारंभिक विकास चरण7में भ्रूण गुर्दे जैसा दिखता है।
एएससी-व्युत्पन्न मानव गुर्दे ट्यूबुलॉइड को वयस्क गुर्दे के एपिथेलियम के नवीकरण को फिर से काटना दिखाया गया है। वे मुख्य रूप से समीपस्थ ट्यूबल, हेनले के लूप, डिस्टल ट्यूबल, और डक्ट इकट्ठा करने का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसा कि विभिन्न ट्रांसपोर्टर प्रोटीन8,9,10की अभिव्यक्ति द्वारा पुष्टि की गई है। ट्यूबुलॉयड संस्कृति प्रोटोकॉल एक स्थिर जीनोम को बनाए रखते हुए रोगी-व्युत्पन्न गुर्दे के ऊतकों के तेजी से विस्तार के लिए अनुमति देता है। शोध अनुप्रयोगों में सामान्य गुर्दे के शरीर विज्ञान, नेफ्रोटॉक्सिकिटी, दवा परीक्षण के साथ-साथ रोग मॉडलिंग8,10, 11,12का अध्ययन करना शामिल है। ट्यूबुलॉइड सहित रोगी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की स्थापना की एक संभावित सीमा, ताजा ऊतक की उपलब्धता है। हालांकि, कई रिपोर्टों से पता चला है कि मूत्र गुर्दे की एपिथेलियल कोशिकाओं के लिए एक स्रोत के रूप में काम कर सकता है, जिससे ट्यूबुलाइड संस्कृतियों8,13, 14के लिए रोगी सामग्री प्राप्त करने के लिए एक बहुतसरल,कम आक्रामक रणनीति प्रदान कीजातीहै। दरअसल, हाल ही में यह दिखाया गया है कि ट्यूबुलॉइड मूत्र8से उगाया जा सकता है। यह लेख गुर्दे के ऊतकों और मूत्र से ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की स्थापना और रखरखाव का वर्णन करता है।
ऑर्गेनॉइड को ऊतक के अवतार माना जाता है जिससे वे प्राप्त होते हैं। वे मूल के ऊतकों की जीनोटिक और फेनोटाइपिक विशेषताओं को बनाए रखतेहुएरोगी सामग्री के तेजी से विस्तार की अनुमति देते हैं । ऑर्गेनॉइड तकनीक ने हाल ही में अधिक प्रतिनिधि प्रीक्लिनिकल मॉडल के विकास के लिए दरवाजे खोले हैं, जिनका उपयोग बेंच से बेडसाइड तक निष्कर्षों का अनुवाद करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरणों के रूप में किया जा सकता है। किडनी ट्यूबुलॉइड दवा-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिकिटी के परीक्षण के लिए विट्रो मॉडल में आशाजनक हैं, जो कई कीमोथैरेपी दवाओं2,8,12का एक आम दुष्प्रभाव है। इस प्रकार, रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइडसंस्कृतियों को उपचार16, 17,18के प्रति रोगी प्रतिक्रिया के लिए भविष्य कहनेवाला होने का प्रदर्शन किया गया था। ट्यूबुलॉइड पर एक उच्च थ्रूपुट तरीके से दवाओं का परीक्षण इसलिए संभावित रूप से चिकित्सीय खिड़कियों की बेहतर परिभाषा की अनुमति देता है और रोगियों में दवा-प्रेरित नेफ्रोटॉक्सिकिटी के जोखिम को कम करता है।
आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली एंटीबायोटिक दवाओं को19गुर्दे पर विषाक्त प्रभाव डालने के लिए वर्णित किया गया है । हालांकि व्यापक स्पेक्ट्रम एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति संदूषण को रोकने के द्वारा संस्कृतियों की सफल स्थापना के लिए आवश्यक है, यह उनकी संभावित nephrotoxicity पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि ट्यूबुलाइड संस्कृतियों की स्थापना पर एंटीबायोटिक दवाओं का कोई नकारात्मक प्रभाव नहीं देखा गया है, लेकिन उनके प्रभावों का अच्छी तरह से मूल्यांकन करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है । ट्यूबुलाइड का अध्ययन और मॉडलिंग रोगों के लिए शोषण किया जा सकता है8. सिलिओपैथी (सिलिया की रोगीय शिथिलता) के साथ-साथ गुर्दे को प्रभावित करने वाले अन्य आनुवंशिक सिंड्रोम का अध्ययन या तो प्रभावित विषयों से सीधे ट्यूबुलाइड लाइनें पैदा करके किया जा सकता है, या स्वस्थ संस्कृतियों का उपयोग करके जिसमें रोग-विशिष्ट चालक उत्परिवर्तन CRISPR/Cas9 जीनोम संपादन20के माध्यम से पेश किया जा सकता है ।
यद्यपि ट्यूबुलॉइड बहुकोशिकीय गुर्दे की संस्कृतियां हैं, लेकिन उनमें कई गुर्दे की कोशिका प्रकारों की कमी है, जिनमें पोडोसाइट्स और एंडोथेलियल कोशिकाएं8शामिल हैं। इसके अलावा, कुछ अन्य एएससी-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड मॉडल के विपरीत, ट्यूबुलॉइड में सीमित प्रतिकृति क्षमता होती है क्योंकि उन्हें लगभग 15 मार्गों के लिए सुसंस्कृत किया जा सकता है। हालांकि, इस सीमित उम्र को संस्कृति माध्यम21में WNT के अलावा काफी बढ़ाया जा सकता है। अधिक विभेदित कोशिका प्रकारों सहित उन्हें गुर्दे का और भी अधिक प्रतिनिधि बनाने के लिए ट्यूबुलाइड संस्कृति प्रोटोकॉल का और अधिक अनुकूलन आवश्यक है। यद्यपि ऊतक नमूनों से ट्यूबुलाइड स्थापना की दक्षता बहुत अधिक है (>95%), यह दुर्लभ मामलों में विफल हो सकती है। इसमें विभिन्न कारण हो सकते हैं: 1) प्रारंभिक सामग्री की खराब गुणवत्ता(उदाहरण के लिए,दवा उपचार के परिणामस्वरूप परिगलित ऊतक), 2) ऊतक नमूने की अधिक अपच, या 3) प्राथमिक नमूने का संदूषण।
यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्राप्त ऊतक नमूनों की गुणवत्ता प्रोटोकॉल के साथ आगे बढ़ने के लिए पर्याप्त है, सर्जरी पर ऊतक के मूल्यांकन को निष्पादित करने वाले पैथोलॉजी कर्मचारियों के साथ घनिष्ठ संपर्क बनाए रखना महत्वपूर्ण है। यदि पर्याप्त सामग्री उपलब्ध है, तो इसकी व्यवहार्यता की पुष्टि हिस्टोलॉजिकल परीक्षा(जैसे,हेमटॉक्सीलिन और ियोसिन स्टेनिंग) द्वारा की जानी चाहिए। इसके अलावा, एंजाइमेटिक पाचन के दौरान सेल लाइसिस को रोकने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि इनक्यूबेशन प्रक्रिया अब 1 घंटे से अधिक नहीं है। अंत में, संदूषण को रोकने के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीफंगल एजेंटों को धोने और संस्कृति मीडिया में जोड़ा जाना चाहिए ।
मूत्र में एक्सफोलिएटेड एपिथेलियल कोशिकाएं हो सकती हैं जो गुर्दे22से प्राप्त नहीं होती हैं, जो ट्यूबुलाइड संस्कृतियों को दूषित कर सकती हैं। इनमें, उदाहरण के लिए, मूत्र सेतुलियम कोशिकाएं शामिल हैं, जो गुर्दे की ट्यूबलर कोशिकाओं के विपरीत, ट्यूमर प्रोटीन P63 के लिए सकारात्मक और पैक्स88के लिए नकारात्मक हैं। इसलिए अनुवर्ती प्रयोगों(चित्रा 4B)के साथ आगे बढ़ने से पहले स्थापित गुर्दे ट्यूबुलाइड लाइनों की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए पैक्स8 सकारात्मकता के लिए संस्कृतियों का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है।
मूत्र उच्च ऑस्मोटिक दबाव और कम पीएच के कारण कोशिकाओं के लिए एक शत्रुतापूर्ण वातावरण का प्रतिनिधित्व करता है। इसलिए प्रोटोकॉल की सफलता के लिए यह महत्वपूर्ण है कि मूत्र संग्रह पर जितनी जल्दी हो सके नमूनों को संसाधित किया जाता है। इस प्रकार, एकत्र किए गए मूत्र को सीडिंग के समय व्यवहार्य कोशिकाओं की उपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए जितनी जल्दी हो सके बफर समाधान के साथ पतला और बड़े पैमाने पर धोया जाना चाहिए। यदि मूत्र प्रसंस्करण से पहले कई घंटों तक संग्रहीत किया जाता है तो ट्यूबुलाइड प्रतिष्ठान की सफलता दर में काफी कमी आएगी। अंत में, हालांकि बाँझ, मूत्र संग्रह प्रक्रिया के साथ जुड़े संदूषण का एक उच्च जोखिम है । इसलिए एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीफंगल एजेंटों के साथ धोने और विकास माध्यम को पूरक करना महत्वपूर्ण है। उपरोक्त सभी को ध्यान में रखते समय, लगभग 50% की सफलता दर प्राप्त की जा सकती है।
The authors have nothing to disclose.
हम अध्ययन में भाग लेने के लिए सभी रोगियों और उनके परिवारों को धन्यवाद देते हैं । हम नैदानिक टीम है जो हमारे अनुसंधान की सुविधा का शुक्रिया अदा करते हैं । हम यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) अनुदान 850571 (जद), डच कैंसर सोसायटी (KWF)/Alpe डी HuZes बास Mulder पुरस्कार (नंबर १०२१८, जद), Oncode संस्थान, और फाउंडेशन बच्चों के कैंसर मुक्त (KiKa नंबर २९२, सी.C) शुरू के समर्थन के लिए आभारी हैं ।
A83-01 | Tocris | 2939/10 | Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
antiPAX8 antibody | LSBio | LS-B13466 | |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Stock of 50x, final concentration of 1x |
BME | Trevigen | 3533-010-02 | |
Collagenase | Sigma Aldrich | C9407 | Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL |
GlutaMAX – L-alanine/L-glutamine | Gibco | 35050061 | Stock of 100x, final concentration of 1x |
Hepes | Gibco | 15630106 | Stock of 1 M, final concentration of 10 mM |
Multiwell tissue culture plates 12 wells | CELLSTAR | 665180 | |
Multiwell tissue culture plates 24 wells | CELLSTAR | 662160 | |
Multiwell tissue culture plates 6 wells | CELLSTAR | 657160 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140163 | Stock of 10.000 U/mL, final concentration of 100 U/mL |
Primocin – broad-range antibiotics | Invivogen | ant-pm-1 | Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL |
Red blood cells lysis buffer | Roche | 11814389001 | |
RhoKinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM |
R-spondin conditioned medium | Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10% | ||
TrypLe Express/ trypsin replacement agent | ThermoFisher Scientific | 12605010 |