Mänskliga njure tubuloid kulturer representerar en värdefull in vitro modell för att studera njure fysiologi och sjukdom. Tubuloider kan etableras från njurvävnad (frisk och sjuk) samt urin, den senare representerar en lättåtkomlig och mindre invasiv källa till forskningsmaterial.
Vuxna stamceller (ASC)-härledda humana njure epitelorganoider, eller tubuloider, kan fastställas från friska och sjuka njure epitel med hög effektivitet. Normala njure tubuloider rekapitulera många aspekter av deras ursprungsvävnad. De representerar distinkta nephronsegment – särskilt av den proximala tubuleen, slingan av Henle, distala tubules och samlande kanal – och kan användas för att studera normal njurfysiologi. Dessutom underlättar tubuloidteknik sjukdomsmodellering, t.ex.för infektionssjukdomar såväl som för cancer. Erhållande njure epitelceller för tubuloid generation är dock beroende av överblivna kirurgiska material (såsom partiella) nephrectomies) eller nål tarmbiopsier. Förmågan att odla tubuloider från urin skulle ge en alternativ, mindre invasiv källa till friska njure epitelceller. Det har tidigare visat sig att tubuloidkulturer framgångsrikt kan genereras från endast några milliliter nyuppsamlad urin. Denna artikel beskriver protokollen för att generera och föröka ASC-härledda mänskliga njure tubuloid kulturer från vävnad och urin prover.
Njurar utför funktionen att systemiskt kontrollera balansen i kroppsvätskor. Försämringen av deras fysiologiska funktion kan orsakas av olika faktorer, inklusive diabetes, högt blodtryck och läkemedelsinducerad toxicitet1. För en bättre förståelse av normal njurfysiologi samt utveckling av njursjukdomar är användningen av representativa prekliniska modeller avgörande. Under de senaste åren har flera in vitro njurmodeller genererats baserat på den så kallade organoidtekniken2. Organoider är tredimensionella, multicellulära strukturer som liknar vävnadens morfologi och fysiologi (normal eller sjuk) från vilken de härstammar. De kan genereras från pluripotenta (PSC) eller vuxna stamceller (ASCs), var och en med sina egna egenskaper och applikationer.
PSC-härledda njurorganoider efterliknar nefropgenes3,4,5. De kan också fastställas från patient-härledda engagerade celler genom påtvingad dedifferentiering (inducerad pluripotens eller iPSC). iPSCs kan därefter differentieras till de olika celltyperna av nephron, den funktionella enheten i njuren, genom snabb exponering för specifika tillväxtfaktorcocktails. Samtidigt som de skapar ett ganska komplett miniorgan i en maträtt, är deras etablering fortfarande tidskrävande, och på grund av omprogrammeringsprotokollet kan iPSCs vara mottagliga för oönskad genetisk instabilitet6. Dessutom kan iPSC-organoider inte fullt mogna till vuxna njurceller, vilket avslöjar en transkriptomprofil som liknar foster njuren i ett tidigt utvecklingsstadium7.
ASC-härledda mänskliga njure tubuloider har visat sig rekapitulera förnyelsen av vuxna njure epitel. De representerar främst den proximala tubuleen, slingan av Henle, distala tubules och samlande kanal, vilket bekräftas av uttrycket av olika transportörproteiner8,9,10. Tubuloidkulturprotokollet möjliggör snabb expansion av patientledd njurvävnad, samtidigt som ett stabilt genom bibehålls. Forskningsapplikationer inkluderar studier av normal njurfysiologi, nefrotoxicitet, drogtestning, samt sjukdomsmodellering8,10,11,12. En potentiell begränsning av etableringen av patientbaserade organoidkulturer, inklusive tubuloider, är tillgången på färsk vävnad. Flera rapporter har dock visat att urin kan fungera som en källa för njure epitelceller, vilket ger en mycket enklare, mindre invasiv strategi för att få patientmaterial för tubuloidkulturer8,13,14. Det har faktiskt nyligen visat sig att tubuloider kan odlas från urin8. Denna artikel beskriver etablering och underhåll av tubuloid kulturer från njurvävnad och urin.
Organoider anses vara avatarer av den vävnad från vilken de härleds. De möjliggör snabb expansion av patientmaterial samtidigt som de behåller de genotypiska och fenotypiska egenskaperna hos ursprungsvävnaden15. Organoid teknik har nyligen öppnat dörrarna för utveckling av mer representativa prekliniska modeller, som kan användas som viktiga verktyg för att översätta resultaten från bänken till sängen. Njure tubuloider är lovande in vitro-modeller för testning av läkemedelsinducerad nefrotoxicitet, en vanlig biverkning av många kemoterapeutiska läkemedel2,8,12. Som sådan visades patient-härledda tumör organoid kulturer vara prediktiv för patientens svar på behandling16,17,18. Testning av läkemedel på ett höggenomströmningssätt på tubuloider möjliggör därför potentiellt bättre definition av terapeutiska fönster och minskar risken för läkemedelsinducerad nefrotoxicitet hos patienter.
Vanliga antibiotika har beskrivits för att utöva en toxisk effekt på njurarna19. Även om förekomsten av bredspektrumantibiotika är nödvändig för att framgångsrikt etablera kulturerna genom att förhindra kontaminering, är det viktigt att överväga deras potentiella nefrotoxicitet. Även om inga negativa effekter av antibiotika har observerats på upprättandet av tubuloid kulturer, ytterligare undersökning behövs för att noggrant utvärdera deras effekter. Tubuloider kan utnyttjas för studier och modellering av sjukdomar8. Ciliopathies (patologisk dysfunktion av cilia) liksom andra genetiska syndrom som påverkar njuren kan studeras genom att antingen generera tubuloidlinjer direkt från drabbade försökspersoner, eller genom att använda friska kulturer där sjukdomsspecifika förarmutationer kan introduceras via CRISPR/ Cas9 genomredigering20.
Även om tubuloider är multicellulära njurkulturer, saknar de flera njurcellstyper, inklusive podocyter och endotelceller8. Dessutom, i motsats till vissa andra ASC-härledda organoidmodeller, har tubuloider en begränsad replikativ potential eftersom de kan odlas för cirka 15 passager. Denna begränsade livslängd kan dock förlängas avsevärt genom att Wnt tillförs kulturmediet21. Ytterligare optimering av tubuloid kultur protokollet krävs för att göra dem ännu mer representativa för njuren, inklusive mer differentierade celltyper. Även om effektiviteten av tubuloid etablering från vävnad prover är mycket hög (>95%), Det kan i sällsynta fall misslyckas. Det kan finnas olika orsaker, inklusive: 1) dålig kvalitet på utgångsmaterialet(t.ex.nekrotisk vävnad till följd av läkemedelsbehandling), 2) överdedigering av vävnadsprovet eller 3) kontaminering av det primära provet.
För att säkerställa att kvaliteten på de mottagna vävnadsproverna är tillräcklig för att fortsätta med protokollet är det viktigt att upprätthålla nära kontakt med patologipersonalen som utför utvärderingen av vävnaden vid operationen. Om tillräckligt med material finns tillgängligt måste dess livskraft bekräftas genom histologisk undersökning(t.ex.hematoxylin och eosinfärgning). För att förhindra celllys under enzymatisk matsmältning är det dessutom viktigt att inkubationsförfarandet inte är längre än 1 timme. Slutligen, för att förhindra kontaminering, bör antibiotika och svampdödande medel läggas till tvätt- och kulturmedierna.
Urin kan innehålla exfolierad epitelceller som inte härrör frånnjuren 22, som kan förorena tubuloidkulturerna. Dessa inkluderar till exempel urotheliumceller som i motsats till njurslangulära celler är positiva för tumörprotein P63 och negativa för PAX88. Det rekommenderas därför att testa odlingarna för PAX8-positivitet för att bekräfta renheten hos etablerade njur tubuloidlinjer innan du fortsätter med uppföljande experiment (figur 4B).
Urin representerar en fientlig miljö för celler på grund av högt osmotiskt tryck och lågt pH. Det är därför avgörande för protokollets framgång att prover bearbetas så snart som möjligt vid urininsamling. Som sådan bör den insamlade urinen spädas och tvättas i stor utsträckning med buffrad lösning så snart som möjligt för att säkerställa förekomst av livskraftiga celler vid sådd. Framgångsgraden för tubuloidetablering kommer att minska avsevärt om urin lagras i flera timmar före bearbetning. Slutligen, även om urinen är steril, har den stor risk för kontaminering i samband med insamlingsprocessen. Det är därför viktigt att komplettera tvätt- och tillväxtmedium med antibiotika och svampdödande medel. När man tar hänsyn till allt ovanstående kan en framgångsgrad på cirka 50 procent uppnås.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar alla patienter och deras familjer för att de deltagit i studien. Vi tackar det kliniska teamet som underlättade vår forskning. Vi är tacksamma för stödet från Europeiska forskningsrådets (ERC) startbidrag 850571 (J.D.), Holländska cancerföreningen (KWF)/Alpe d’HuZes Bas Mulder Award (nr 10218, J.D.), Oncode Institute och Foundation Children Cancer Free (KiKa nr 292, C.C.)
A83-01 | Tocris | 2939/10 | Stock of 5 mM, final concentration of 5 µM, activin receptor-like kinase 5 inhibitor |
Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634010 | |
antiPAX8 antibody | LSBio | LS-B13466 | |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | Stock of 50x, final concentration of 1x |
BME | Trevigen | 3533-010-02 | |
Collagenase | Sigma Aldrich | C9407 | Stock of 10 mg/mL, final concentration of 1 mg/mL |
EGF | Peprotech | AF-100-15 | Stock of 0.5 mg/mL, final concentration of 50 ng/mL |
FGF10 | Peprotech | 100-26 | Stock of 0.1 mg/mL, final concentration of 100 ng/mL |
GlutaMAX – L-alanine/L-glutamine | Gibco | 35050061 | Stock of 100x, final concentration of 1x |
Hepes | Gibco | 15630106 | Stock of 1 M, final concentration of 10 mM |
Multiwell tissue culture plates 12 wells | CELLSTAR | 665180 | |
Multiwell tissue culture plates 24 wells | CELLSTAR | 662160 | |
Multiwell tissue culture plates 6 wells | CELLSTAR | 657160 | |
N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | A9165 | Stock of 500 mM, final concentration of 1.25 mM |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140163 | Stock of 10.000 U/mL, final concentration of 100 U/mL |
Primocin – broad-range antibiotics | Invivogen | ant-pm-1 | Stock of 50 mg/mL, final concentration of 0.1 mg/mL |
Red blood cells lysis buffer | Roche | 11814389001 | |
RhoKinase inhibitor Y-27632 | Abmole Bioscience | M1817 | Stock of 100 mM, final concentration of 10 µM |
R-spondin conditioned medium | Produced in house with the use of stable cell lines generated by Calvin Kuo lab. Final concentration is 10% | ||
TrypLe Express/ trypsin replacement agent | ThermoFisher Scientific | 12605010 |