Colorazione immunofluorescente per la visualizzazione delle proteine associate all'eterocromatina nelle ghiandole salivari della Drosophila
Summary
Questo protocollo mira a visualizzare gli aggregati di eterocromatina nelle cellule di politene di Drosophila.
Abstract
La visualizzazione degli aggregati di eterocromatina mediante immunosocienza può essere impegnativa. Molti componenti mammiferi della cromatina sono conservati in Drosophila melanogaster. Pertanto, è un modello eccellente per studiare la formazione e la manutenzione dell’eterocromatina. Le cellule politenizzate, come quelle che si trovano nelle ghiandole salivari di larve di terzo instar D. melanogaster, forniscono uno strumento eccellente per osservare la cromatina amplificata quasi mille volte e hanno permesso ai ricercatori di studiare i cambiamenti nella distribuzione dell’eterocromatina nel nucleo. Sebbene l’osservazione dei componenti dell’eterocromatina possa essere effettuata direttamente nei preparati cromosomici di politene, la localizzazione di alcune proteine può essere alterata dalla gravità del trattamento. Pertanto, la visualizzazione diretta dell’eterocromatina nelle cellule completa questo tipo di studio. In questo protocollo, descriviamo le tecniche di immunostaining utilizzate per questo tessuto, l’uso di anticorpi fluorescenti secondari e la microscopia confocale per osservare questi aggregati di eterocromatina con maggiore precisione e dettaglio.
Introduction
Fin dai primi studi di Emil Heitz1,l’eterocromatina è stata considerata un importante regolatore dei processi cellulari come l’espressione genica, la separazione meiotica e mitotica dei cromosomi e il mantenimento della stabilità delgenoma 2,3,4.
L’eterocromatina è principalmente divisa in due tipi: l’eterocromatina costitutiva che definisce tipicamente sequenze ripetitive e gli elementi trasponibili presenti in specifici siti cromosomici come i telomeri e i centromeri. Questo tipo di eterocromatina è definito principalmente epigeneticamente da specifici segni istonosi come la di o trimetilazione della lisina 9 dell’istone H3 (H3K9me3) e il legame della proteina eterocromatina 1a (HP1a)5,6. D’altra parte, l’eterocromatina facultativa si localizza attraverso le braccia del cromosoma e consiste principalmente di geni silenziati per losviluppo 7,8. L’immunosottenizione di blocchi di eterocromatina nelle cellule metafase, o l’osservazione di aggregati di eterocromatina nelle cellule interfase, ha svelato molta luce nella comprensione della formazione e della funzione delle regioni eterocromomatiche9.
L’uso della Drosophila come sistema modello ha permesso lo sviluppo di strumenti essenziali per studiare l’eterocromatina senza l’uso della microscopia elettronica10. Dalla descrizione della variegatione dell’effetto posizione e dalla scoperta di proteine associate all’eterocromatina, come HP1a, e modifiche post-trasdutazionali istone, molti gruppi hanno sviluppato diverse tecniche immunoistochimiche che consentono la visualizzazione di queste regioni eterocromomatiche10,11.
Queste tecniche si basano sull’uso di anticorpi specifici che riconoscono proteine associate all’eterocromatina o segni istonali. Per ogni tipo di cellula e anticorpo, le condizioni di fissazione e permeabilizzazione devono essere determinate empiricamente. Inoltre, le condizioni possono variare se vengono utilizzati ulteriori processi meccanici come le tecniche di squashing. In questo protocollo, descriviamo l’uso delle ghiandole salivari della Drosophila per studiare i focolai eterocromatici. Le ghiandole salivari hanno cellule politenizzate che contengono più di 1.000 copie del genoma, fornendo così una visione amplificata della maggior parte delle caratteristiche della cromatina, ad eccezione del DNA satellitare e di alcune regioni eterocromatiche che sono sotto replicate. Tuttavia, le regioni dell’eterocromatina sono facilmente visualizzabili nei preparati cromosomici del politene, ma le tecniche di schiacciamento possono talvolta interrompere i complessi caratteristici legati alla cromatina o l’architettura della cromatina. Pertanto, l’immunolocalizzazione delle proteine in tutto il tessuto della ghiandola salivare può superare questi effetti indesiderati. Abbiamo utilizzato questo protocollo per rilevare diverse proteine legate alla cromatina, e abbiamo dimostrato che questo protocollo combinato con le scorte mutanti di Drosophila può essere utilizzato per studiare l’interruzione dell’eterocromatina12.
Protocol
Representative Results
Discussion
La funzione cellulare degli organismi eucarioti può definire la struttura 3D all’interno del nucleo, che è supportata da interazioni tra diverse proteine con cromatina e varie molecole tra cui l’RNA. Negli ultimi tre anni, i condensati biologici che hanno avuto rilevanza, compresa l’eterocromatina, hanno assunto un ruolo fondamentale nella determinazione della separazione di fase promuovendo la distinta organizzazione spaziale nucleare della cromatina attiva e repressiva 16,<sup class…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Marco Antonio Rosales Vega e Abel Segura per aver scattato alcune delle immagini confocali, Carmen Muñoz per la preparazione dei media e il Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui e il Dr. Chris Wood della LMNA per consigli sull’uso dei microscopi.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
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