Immunfluoreserende farging for visualisering av Heterochromatin assosierte proteiner i Drosophila spyttkjertler

Summary

Denne protokollen tar sikte på å visualisere heterochromatin aggregater i Drosophila polytene celler.

Abstract

Visualisering av heterochromatin aggregater ved immunstaining kan være utfordrende. Mange pattedyrkomponenter av kromatin er bevart i Drosophila melanogaster. Derfor er det en utmerket modell for å studere heterochromatindannelse og vedlikehold. Polyteniserte celler, som de som finnes i spyttkjertler av tredje instar D. melanogaster larver, gir et utmerket verktøy for å observere kromatin forsterket nesten tusen ganger og har tillatt forskere å studere endringer i fordelingen av heterokromatin i kjernen. Selv om observasjonen av heterokromatinkomponenter kan utføres direkte i polytene kromosompreparater, kan lokaliseringen av noen proteiner endres av alvorlighetsgraden av behandlingen. Derfor utfyller direkte visualisering av heterokromatin i celler denne typen studier. I denne protokollen beskriver vi immunoppfatningsteknikker som brukes for dette vevet, bruk av sekundære fluorescerende antistoffer og konfiskert mikroskopi for å observere disse heterokromatinaggregatene med større presisjon og detaljer.

Introduction

Siden de tidlige studiene av Emil Heitz¹har heterokromatin blitt ansett som en viktig regulator av cellulære prosesser som genuttrykk, meiotisk og mititotisk separasjon av kromosomer og vedlikehold av genomstabilitet^2,3,4.

Heterochromatin er hovedsakelig delt inn i to typer: konstituerende heterokromatin som karakteristisk definerer repeterende sekvenser og transponerbare elementer som er til stede på spesifikke kromosomsteder som telomerer og sentromerer. Denne typen heterokromatin er hovedsakelig definert epigenetisk av spesifikke histone merker som di eller tri-metylering av lysin 9 av histone H3 (H3K9me3) og bindingen av Heterochromatin protein 1a (HP1a)^5,6. På den annen side lokaliserer fakultets heterochromatin gjennom kromosomets armer og består hovedsakelig av utviklingshemmelige gener^7,8. Immunostaining av heterokromatinblokker i metafaseceller, eller observasjon av heterokromatinaggregater i interfaseceller, har avduket mye lys i forståelsen av dannelsen og funksjonen til heterokromatiske regioner⁹.

Bruken av Drosophila som modellsystem har gjort det mulig å utvikle essensielle verktøy for å studere heterokromatin uten bruk av elektronmikroskopi¹⁰. Siden beskrivelsen av posisjonseffektvariasjon og oppdagelsen av heterokromatin-assosierte proteiner, som HP1a og histone post-translasjonelle modifikasjoner, har mange grupper utviklet flere immunhiistokjemiske teknikker som tillater visualisering av disse heterochromatiske områdene^10,11.

Disse teknikkene er basert på bruk av spesifikke antistoffer som gjenkjenner heterokromatin-assosierte proteiner eller histone merker. For hver celletype og antistoff må fikserings- og permeabiliseringsbetingelsene bestemmes empirisk. Forholdene kan også variere hvis ytterligere mekaniske prosesser som squashing teknikker brukes. I denne protokollen beskriver vi bruken av Drosophila spyttkjertler for å studere heterokromatisk foci. Spyttkjertler har polyteniserte celler som inneholder mer enn 1000 kopier av genomet, og gir dermed et forsterket syn på de fleste kromatinfunksjonene, med unntak av satellitt-DNA og noen heterokromatiske regioner som er under replikert. Likevel er heterokromatinregioner lett visualisert i polytene kromosompreparater, men squashingteknikkene kan noen ganger forstyrre karakteristiske kromatinbundne komplekser eller kromatinarkitekturen. Derfor kan immunokalisering av proteiner i hele spyttkjertelvev overgå disse uønskede effektene. Vi har brukt denne protokollen til å oppdage flere kromatinbundne proteiner, og vi har vist at denne protokollen kombinert med mutant Drosophila-aksjer kan brukes til å studere heterokromatinforstyrrelser¹².

Protocol

1. Tredje instar larver kultur Forbered 1 liter standardmedier ved å legge til 100 g gjær, 100 g uraffinert hele sukkerrør, 16 g agar, 10 ml propionsyre og 14 g gelatin. Løs opp alle ingrediensene unntatt gjæren i 800 ml vann fra springen og oppløs deretter gjæren. Autoklav umiddelbart i 30 minutter. Etterpå, la media avkjøle ned til 60 °C og tilsett propionsyre til en endelig konsentrasjon 0,01%. La flasken stå til gelatin er dannet. For å optimalisere 3o instar larve…

Representative Results

Representative resultater av HP1a-immunostaining i Drosophila spyttkjertler er vist i figur 1. Et positivt resultat er å observere ett fokuspunkt (figur 1a) (heterochromatisk aggregat eller kondensat). Et negativt resultat er ikke noe signal eller et spredt signal. Noen ganger kan man observere et dobbeltsignal, det vilt med et dobbeltpunkt (figur 1c), men det forekommer vanligvis i mindre mengder. <p class="jove_conte…

Discussion

Den cellulære funksjonen til eukaryote organismer kan definere 3D-strukturen i kjernen, som støttes av interaksjoner mellom forskjellige proteiner med kromatin og ulike molekyler, inkludert RNA. I løpet av de siste tre årene har de biologiske kondensatene som har hatt relevans, inkludert heterokromatin, tatt en grunnleggende rolle i bestemmelsen av faseseparasjonen som fremmer den distinkte kjernefysiske romlige organiseringen av aktiv og undertrykkende kromatin ^16,<sup class="xref"…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22×22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H3BO3	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical