Tinción Inmunofluorescente Para La Visualización De Proteínas Asociadas A La Heterocromatina En Las Glándulas Salivales Drosophila

Summary

Este protocolo tiene como objetivo visualizar agregados de heterocromatina en células de Politeno de Drosophila.

Abstract

La visualización de los agregados de la heterocromatina immunostaining puede ser desafiadora. Muchos componentes mamíferos de la cromatina se conservan en Drosophila melanogaster. Por lo tanto, es un excelente modelo para estudiar la formación y el mantenimiento de la heterocromatina. Las células politenizadas, como las que se encuentran en las glándulas salivales de las larvas de D. melanogaster de tercer estadio, proporcionan una excelente herramienta para observar la cromatina amplificada casi mil veces y han permitido a los investigadores estudiar los cambios en la distribución de la heterocromatina en el núcleo. Aunque la observación de los componentes de la heterocromatina se puede llevar a cabo directamente en preparaciones cromosómicas de politeno, la localización de algunas proteínas puede verse alterada por la gravedad del tratamiento. Por lo tanto, la visualización directa de la heterocromatina en las células complementa este tipo de estudio. En este protocolo, describimos las técnicas immunostaining usadas para este tejido, el uso de anticuerpos fluorescentes secundarios, y la microscopia confocal de observar estos agregados de la heterocromatina con mayor precisión y detalle.

Introduction

Desde los primeros estudios de Emil Heitz^1,la heterocromatina ha sido considerada un importante regulador de procesos celulares como la expresión génica, la separación meiótica y mitótica de los cromosomas, y el mantenimiento de la estabilidad del genoma^2,3,4.

La heterocromatina se divide principalmente en dos tipos: heterocromatina constitutiva que define característicamente secuencias repetitivas, y elementos transponibles que están presentes en sitios cromosómicos específicos como los telómeros y centrómeros. Este tipo de heterocromatina se define principalmente epigenéticamente por marcas de histonas específicas como la di o tri-metilación de la lisina 9 de la histona H3 (H3K9me3) y la unión de la proteína heterocromatina 1a (HP1a)^5,6. Por otro lado, la heterocromatina facultativa se localiza a través de los brazos del cromosoma y consiste principalmente en genes silenciados por el desarrollo^7,8. La inmunotinción de bloques de heterocromatina en células metafásicas, o la observación de agregados de heterocromatina en células interfase, ha revelado mucha luz en la comprensión de la formación y función de las regiones heterocromáticas^9.

El uso de Drosophila como sistema modelo ha permitido el desarrollo de herramientas esenciales para estudiar la heterocromatina sin el uso de microscopía electrónica^10. Desde la descripción de la posición del efecto variegación y el descubrimiento de proteínas asociadas a la heterocromatina, como la HP1a, y las modificaciones postraduccionales de histonas, muchos grupos han desarrollado varias técnicas inmunohistoquímicas que permiten la visualización de estas regiones heterocromáticas^10,11.

Estas técnicas se basan en el uso de anticuerpos específicos que reconocen proteínas asociadas a la heterocromatina o marcas de histonas. Para cada tipo de célula y anticuerpo, las condiciones de fijación y permeabilización deben determinarse empíricamente. Además, las condiciones pueden variar si se utilizan procesos mecánicos adicionales como técnicas de aplastamiento. En este protocolo, describimos el uso de las glándulas salivales de Drosophila para estudiar focos heterocromáticos. Las glándulas salivales tienen células politenizadas que contienen más de 1.000 copias del genoma, proporcionando así una vista amplificada de la mayoría de las características de la cromatina, con la excepción del ADN satélite y algunas regiones heterocromáticas que están poco replicadas. Sin embargo, las regiones de la heterocromatina se visualizan fácilmente en preparaciones del cromosoma del politeno, pero las técnicas que aplastan pueden interrumpir a veces los complejos cromatina-limitados característicos o la arquitectura de la cromatina. Por lo tanto, la inmunolocalización de proteínas en el tejido entero de la glándula salival puede superar estos efectos no deseados. Hemos utilizado este protocolo para detectar varias proteínas ligadas a la cromatina, y hemos demostrado que este protocolo combinado con cepas mutantes de Drosophila puede ser utilizado para estudiar la disrupción de la heterocromatina^12.

Protocol

1. Cultivo de larvas de tercer estadio Preparar 1 litro de medio estándar añadiendo 100 g de levadura, 100 g de azúcar de caña entera sin refinar, 16 g de agar, 10 mL de ácido propiónico y 14 g de gelatina. Disuelva todos los ingredientes excepto la levadura en 800 mL de agua del grifo y luego disuelva la levadura. Autoclave inmediatamente durante 30 minutos. Después, deje que el medio se enfríe a 60 °C y agregue ácido propiónico a una concentración final al 0.01%. Dejar reposar la botella h…

Representative Results

Los resultados representativos de la inmunotensión de HP1a en las glándulas salivales de Drosophila se muestran en la Figura 1. Un resultado positivo es observar un punto focal(Figura 1a)(agregado heterocromático o condensado). Un resultado negativo es ninguna señal o una señal dispersa. A veces se puede observar una señal doble, es decir, con un punto doble (Figura 1c), pero por lo general se produce en cantidades m?…

Discussion

La función celular de los organismos eucariotas puede definir la estructura 3D dentro del núcleo, que está respaldada por interacciones entre diferentes proteínas con cromatina y varias moléculas, incluido el ARN. En los últimos tres años, los condensados biológicos que han tenido relevancia, incluida la heterocromatina, han tomado un papel fundamental en la determinación de la separación de fases promoviendo la organización espacial nuclear distinta de la cromatina activa y represiva ^16,</su…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Axygen MCT-150-C	11351904	brand not critical
16% formaldehyde	Thermo Scientific	28908
AF1 Citifluor	Ted pella	19470	25 mL
BSA, Molecular Biology Grade	Roche	10735078001	brand not critical
Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors	Merck	5892953001
Coverslip	Corning	CLS285022-200EA	22×22, brand not critical
DTT	Sigma	d9779	brand not critical
EDTA	Sigma	E5134	brand not critical
EGTA			brand not critical
Glass slide	Gold seal	3011	brand not critical
H3BO3	Baker	0084-01	brand not critical
H3K9me3	Abcam	8889
HP1a	Hybridoma Bank	C1A9	Product Form Concentrate 0.1 mL
KCl	Baker	3040-01	brand not critical
Methanol	Baker	9070-03	brand not critical
NaCl	Sigma	71376	brand not critical
NaOH			brand not critical
PIPES			brand not critical
Rotator	Thermo Scientific	13-687-12Q	Labquake Tube Shaker
Thermo Mixer C	Eppendorf	13527550	SmartBlock 1.5 mL
Tris	Milipore	648311	brand not critical
Triton X-100	Sigma	T8787	100 mL, brand not critical
β-mercaptoethanol	Bio-Rad	1610710	25 mL, brand not critical