Drosophila Tükürük Bezlerinde Heterokromatin İlişkili Proteinlerin Görselleştirilmesi için İmmünofluoresan Boyama
Summary
Bu protokol, Drosophila politen hücrelerindeki heterokromatin agregalarını görselleştirmeyi amaçlamaktadır.
Abstract
Heterokromatin agregalarının immünostainleme ile görselleştirilmesi zor olabilir. Kromatin birçok memeli bileşeni Drosophila melanogaster’da korunur. Bu nedenle, heterokromatin oluşumunu ve bakımını incelemek için mükemmel birmodeldir. Üçüncü instar D. melanogaster larvalarının tükürük bezlerinde bulunanlar gibi politenize hücreler, yaklaşık bin kez yükseltilen kromatinleri gözlemlemek için mükemmel bir araç sağlar ve araştırmacıların çekirdekteki heterokromatin dağılımındaki değişiklikleri incelemelerine izin verir. Heterokromatin bileşenlerinin gözlemi doğrudan politen kromozom preparatlarında yapılsa da, bazı proteinlerin lokalizasyonu tedavinin şiddeti ile değiştirilebilir. Bu nedenle, hücrelerde heterokromatin’in doğrudan görselleştirilmesi bu tür bir çalışmayı tamamlar. Bu protokolde, bu doku için kullanılan immünostaining tekniklerini, sekonder floresan antikorların kullanımını ve bu heterokromatin agregalarını daha fazla hassasiyet ve ayrıntıyla gözlemlemek için konfokal mikroskopiyi açıklıyoruz.
Introduction
Emil Heitz1’inilk çalışmalarından bu yana heterokromatin gen ekspresyonu, kromozomların meiotik ve mitotik ayrılması ve genom stabilitesinin korunması gibi hücresel süreçlerin önemli bir düzenleyicisi olarak kabul edilmiştir2,3,4.
Heterokromatin esas olarak iki türe ayrılır: karakteristik olarak tekrarlayan dizileri tanımlayan konsitutive heterokromatin ve telomerler ve centromeres gibi belirli kromozom bölgelerinde bulunan transpoze edilebilir elementler. Bu tür heterokromatin esas olarak H3 (H3K9me3) histone 9 lizin di veya tri-metilasyonu ve Heterokromatin proteini 1a (HP1a)5,6bağlanması gibi spesifik histone izleri ile epigenetik olarak tanımlanır. Öte yandan, öğretim üyesi heterokromatin kromozomun kollarında lokalize eder ve esas olarak gelişimsel olarak susturulmuş genlerden oluşur7,8. Metafaz hücrelerindeki heterokromatin bloklarının immünostainasyonu veya ara hücrelerdeki heterokromatin agregalarının gözlemlenmesi, heterokromatik bölgelerin oluşumu ve işlevinin anlaşılmasında çok fazla ışık ortaya çıkarmıştır9.
Drosophila’nın bir model sistemi olarak kullanılması, elektron mikroskopisi kullanmadan heterokromatin çalışması için gerekli aletlerin geliştirilmesine izin10. Pozisyon etkisi değişkenliğinin tanımlanması ve HP1a gibi heterokromatin ilişkili proteinlerin keşfi ve çeviri sonrası değişikliklerden bu yana, birçok grup bu heterokromatik bölgelerin görselleştirilmesine izin veren çeşitli immünohistokimyasal teknikler geliştirmiştir10,11.
Bu teknikler, heterokromatin ilişkili proteinleri veya histone izlerini tanıyan spesifik antikorların kullanımına dayanmaktadır. Her hücre tipi ve antikor için fiksasyon ve permeabilizasyon koşulları ampirik olarak belirlenmelidir. Ayrıca, ezme teknikleri gibi ek mekanik işlemler kullanılırsa koşullar değişebilir. Bu protokolde, heterokromatik odakları incelemek için Drosophila tükürük bezlerinin kullanımını açıklıyoruz. Tükürük bezleri, genomun 1.000’den fazla kopyasını içeren politenize hücrelere sahiptir, böylece uydu DNA’sı ve çoğaltılmış olan bazı heterokromatik bölgeler hariç, kromatin özelliklerinin çoğunun genişletilmiş bir görünümünü sağlar. Bununla birlikte, heterokromatin bölgeleri politen kromozom preparatlarında kolayca görselleştirilir, ancak kabarma teknikleri bazen karakteristik kromatin bağlı kompleksleri veya kromatin mimarisini bozabilir. Bu nedenle, tüm tükürük bezi dokusundaki proteinlerin immünolokalizasyonu bu istenmeyen etkileri aşabilir. Bu protokolü birkaç kromatin bağlı proteini tespit etmek için kullandık ve mutant Drosophila stokları ile birlikte bu protokolün heterokromatin bozulmasını incelemek için kullanılabileceğini gösterdik12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ökaryotik organizmaların hücresel işlevi, kromatin ile farklı proteinler ve RNA dahil olmak üzere çeşitli moleküller arasındaki etkileşimlerle desteklenen çekirdek içindeki 3D yapıyı tanımlayabilir. Son üç yılda, heterokromatin de dahil olmak üzere alaka düzeyi olan biyolojik kondensatlar, aktif ve baskıcı kromatin 16 , 17,18’inayrı nükleer mekansal organizasyonuna teşvik eden faz ayrımının belirlenm…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Marco Antonio Rosales Vega ve Abel Segura’ya bazı konfokal görüntüleri aldıkları için, medya hazırlığı için Carmen Muñoz’a ve mikroskopların kullanımı konusunda tavsiyeler için LMNA’dan Dr. Arturo Pimentel, M.C. Andrés Saralegui ve Dr. Chris Wood’a teşekkür ederiz.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Axygen MCT-150-C | 11351904 | brand not critical |
| 16% formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | |
| AF1 Citifluor | Ted pella | 19470 | 25 mL |
| BSA, Molecular Biology Grade | Roche | 10735078001 | brand not critical |
| Complete, protease inhibitors Ultra EDTA-free protease inhibitors |
Merck | 5892953001 | |
| Coverslip | Corning | CLS285022-200EA | 22×22, brand not critical |
| DTT | Sigma | d9779 | brand not critical |
| EDTA | Sigma | E5134 | brand not critical |
| EGTA | brand not critical | ||
| Glass slide | Gold seal | 3011 | brand not critical |
| H3BO3 | Baker | 0084-01 | brand not critical |
| H3K9me3 | Abcam | 8889 | |
| HP1a | Hybridoma Bank | C1A9 | Product Form Concentrate 0.1 mL |
| KCl | Baker | 3040-01 | brand not critical |
| Methanol | Baker | 9070-03 | brand not critical |
| NaCl | Sigma | 71376 | brand not critical |
| NaOH | brand not critical | ||
| PIPES | brand not critical | ||
| Rotator | Thermo Scientific | 13-687-12Q | Labquake Tube Shaker |
| Thermo Mixer C | Eppendorf | 13527550 | SmartBlock 1.5 mL |
| Tris | Milipore | 648311 | brand not critical |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | 100 mL, brand not critical |
| β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610710 | 25 mL, brand not critical |
References
- Berger, F. Emil Heitz, a true epigenetics pioneer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572 (2019).
- Irick, H. A new function for heterochromatin. Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).
- Kasinathan, B., et al. Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila. Elife. , 1-31 (2020).
- Lifschytz, E., Hareven, D. Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster. Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Lee, Y. C. G., et al. Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin. PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).
- Koryakov, D. E., et al. The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster. Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).
- Cao, R., et al. Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing. Science. 298 (5595), 1039 (2002).
- Hines, K. A., et al. Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading. Génétique. 182 (4), 967-977 (2009).
- Elgin, S. C. R., Reuter, G. Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).
- Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription. Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).
- Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription. BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).
- Tennessen, J. M., Thummel, C. S. Coordinating growth and maturation – Insights from drosophila. Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).
- Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling. Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).
- Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).
- Larson, A. G., Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochimie. 57 (17), 2540-2548 (2018).
- Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α. Methods in Enzymology. , (2018).
- Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, a. J., Eissenberg, J. C. Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila. Génétique. 155 (2), 699-708 (2000).
- Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster. Trends in Genetics. , (2019).
- Strom, A. R., et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).
- Sanulli, S., et al. HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin. Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).
- Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes. Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).
- Kolesnikova, T. D., et al. Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene. Fly. 5 (3), 181-190 (2011).
- Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development. Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).
- Messina, G., et al. Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization. Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).
- Aguilar-Fuentes, J., et al. p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model. PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).
- Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes. Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).
- Farkaš, R., Mechler, B. M. The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response. Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).
- Zhang, P., Spradling, A. C. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin. Génétique. 139 (2), 659-670 (1995).
- Stormo, B. M., Fox, D. T. Polyteny: still a giant player in chromosome research. Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).
