इसमें सीआरआईएसपीआर /सीएएस 9-आधारित जीनोम संपादन के माध्यम से अपने जीनोम को संशोधित करने या जर्मलाइन परिवर्तन के माध्यम से चिह्नित ट्रांसपोसेबल तत्वों को जोड़ने के उद्देश्य से प्रीसेलुलर मकई प्लांटहॉपर भ्रूण को एकत्र करने और माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए प्रोटोकॉल हैं।
मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, मक्का का एक कीट है और कई मक्का वायरस का वेक्टर है। पहले प्रकाशित विधियों में अप्सराओं और वयस्कों में डबल-फंसे आरएनए (डीएसआरएनए) के माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से पी. मैडिस में आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) के ट्रिगर का वर्णन किया गया है। आरएनएआई की शक्ति के बावजूद, इस तकनीक के माध्यम से उत्पन्न फेनोटाइप क्षणिक होते हैं और दीर्घकालिक मेंडेलियन वंशानुक्रम की कमी होती है। इसलिए, पी. मेडिस टूलबॉक्स को कार्यात्मक जीनोमिक उपकरणों को शामिल करने के लिए विस्तारित करने की आवश्यकता है जो स्थिर उत्परिवर्ती उपभेदों के उत्पादन को सक्षम करेगा, जिससे शोधकर्ताओं के लिए इस आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीट पर सहन करने के लिए नए नियंत्रण विधियों को लाने के लिए दरवाजा खुल जाएगा। हालांकि, आरएनएआई के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएसआरएनए के विपरीत, सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-आधारित जीनोम संपादन और जर्मलाइन परिवर्तन में उपयोग किए जाने वाले घटक आसानी से कोशिका झिल्ली को पार नहीं करते हैं। नतीजतन, प्लास्मिड डीएनए, आरएनए, और / या प्रोटीन को भ्रूण सेलुलर होने से पहले भ्रूण में सूक्ष्म इंजेक्शन दिया जाना चाहिए, जिससे इंजेक्शन का समय सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक बन जाता है। उस अंत तक, अपेक्षाकृत कम अंतराल पर पी. मैडिस मादाओं से भ्रूण की कटाई की अनुमति देने के लिए एक अगारोस-आधारित अंडा-ले विधि विकसित की गई थी। इसमें सीआरआईएसपीआर घटकों (सीएएस 9 न्यूक्लियस जिसे गाइड आरएनए के साथ जटिल किया गया है) के साथ पूर्वकोशिकीय पी. मैडिस भ्रूण को एकत्र करने और माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान किए गए हैं, और पी. मेडिस आंख-रंग जीन, सफेद के सीएएस 9-आधारित जीन नॉकआउट के परिणाम प्रस्तुत किए गए हैं। यद्यपि ये प्रोटोकॉल पी. मैडिस में सीआरआईएसपीआर / सीएएस 9-जीनोम संपादन का वर्णन करते हैं, लेकिन उनका उपयोग इंजेक्शन समाधान की संरचना को बदलकर जर्मलाइन परिवर्तन के माध्यम से ट्रांसजेनिक पी मैडिस के उत्पादन के लिए भी किया जा सकता है।
मकई प्लांटहॉपर, पेरेग्रीनस मैडिस, मक्का 1,2,3 का एक आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण कीट है। वे पौधे को प्रत्यक्ष शारीरिक नुकसान पहुंचाते हैं, दोनों अपने छेदने-चूसने वाले मुंह के हिस्सों के साथ भोजन करते समय, और प्रजनन के दौरान जब वे अपने भ्रूण को सीधे पौधे के ऊतकों में डालते हैं 2,4। फसलों को प्रत्यक्ष नुकसान के कई मार्गों के बावजूद, मक्का मोज़ेक वायरस (एमएमवी) और मक्का पट्टी वायरस 5,6 के वेक्टर के रूप में कार्य करके, फसल स्वास्थ्य पर इन कीड़ों का सबसे बड़ा प्रभाव अप्रत्यक्ष है। एमएमवी अपने पी. मेडिस वेक्टर के शरीर में प्रतिकृति बनाने में सक्षम है, जिससे वायरस अपने जीवन की संपूर्णता के माध्यम से व्यक्तिगत कीड़ों में बना रह सकता है, ताकि वे वायरस को नए मेजबान पौधों 7,8 में फैलाना जारी रख सकें। पी. मैडिस को नियंत्रित करने के लिए सबसे आम तरीके, और इस प्रकार वायरस वैक्टर, कीटनाशक हैं।
दुर्भाग्यवश, इन उत्पादों के कुप्रबंधन के कारण लक्षित कीट में प्रतिरोध का विकास हुआ है और साथ ही पर्यावरण का प्रदूषण भीहुआ है। इसलिए, इस कीट/वायरस-कीट संयोजन से फसल के नुकसान को कम करने के लिए नई रणनीतियों की आवश्यकता है। पिछले काम से पता चला है कि आरएनए हस्तक्षेप (आरएनएआई) पी. मैडिस के लिए एक प्रभावी नियंत्रण विधि हो सकती है क्योंकि वे डबल-स्ट्रैंडेड आरएनए (डीएसआरएनए) 10 को निगलने पर भी जीन अभिव्यक्ति में डाउनरेग्यूलेशन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं। हालांकि, क्षेत्र में डीएसआरएनए को प्रशासित करने का सबसे प्रभावी तरीका उन पौधों के माध्यम से होगा जिन पर कीड़े फ़ीड करते हैं; इसलिए, फसलें अभी भी किसी भी वायरस के लिए अतिसंवेदनशील हो सकती हैं जो कीड़े पहले से ही ले जा रहे हैं। CRISPR / Cas9 जीनोम संपादन के आगमन के साथ, नई कीट नियंत्रण रणनीतियां संभव हैं, जिनमें Cas9-आधारित जीन ड्राइव11,12 शामिल हैं, जिसका उपयोग कीट आबादी के आकार को कम करने के लिए किया जा सकता है, या उक्त आबादी को वायरस प्रतिरोधी व्यक्तियों के साथ बदलने के लिए किया जा सकता है।
हालांकि, किसी भी प्रकार की जीन-ड्राइव प्रणाली के विकास और तैनाती के लिए ट्रांसजेनिक तकनीकों के विकास की आवश्यकता होगी। पी. मैडिस में आरएनएआई प्रयोगों को पूरा करने के लिए इस तरह के तरीके आवश्यक नहीं थे क्योंकि डीएसआरएनए और / या एसआईआरएनए को पी. मेडिस10,13 में आरएनएआई की दक्षता के कारण कोशिका झिल्ली को पार करने में सक्षम माना जाता है। यह पारंपरिक ट्रांसजेनेसिस या कैस 9-आधारित जीन संपादन में नियोजित डीएनए और / या प्रोटीन के लिए सच नहीं है, जिनमें से कोई भी जीन ड्राइव ले जाने वाले कीड़े बनाने का अग्रदूत होगा। जीन संपादन या जर्मलाइन परिवर्तन के अन्य रूपों को पूरा करने के लिए, इन डीएनए और प्रोटीन को आदर्श रूप से सिंसाइटियल ब्लास्टोडर्म चरण के दौरान भ्रूण में सूक्ष्म इंजेक्शन दिया जाता है, इससे पहले कि कीट भ्रूण सेलुलर हो जाए। समय महत्वपूर्ण है, क्योंकि समकालिक चरण विकास का सबसे पहला हिस्साहै 14,15. चूंकि पी. मेडिस मादाएं अधिमानतः पौधे के ऊतकों में अपने अंडे देती हैं, सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए पर्याप्त मात्रा में पूर्वकोशिकीय भ्रूण निकालना श्रम-गहन और समय लेने वाला हो सकता है। इसलिए, सेलुलराइजेशन से पहले पी. मैडिस भ्रूण को जल्दी से इकट्ठा करने और माइक्रोइंजेक्ट करने के लिए नई तकनीकें विकसित की गईं।
अंडे देने की गुणवत्ता और पोषण
हाल ही में, एक संबंधित प्रजाति, नीलापर्वता लुगेंस के साथ काम करने वाले शोधकर्ताओं ने सीधे पत्ती से सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले अंडे प्राप्त किए, इंजेक्शन वाले अंडे को पत्ती केऊतकों में तब तक रखा जब तक कि वे 17 नहीं निकल गए। जबकि इस पत्ती-आधारित विधि ने भ्रूण के विकास के लिए अधिक प्राकृतिक वातावरण प्रदान किया, इसने हटाने की प्रक्रिया के दौरान संक्रमण और अंडे की क्षति की संभावना भी बढ़ा दी। यहां प्रस्तुत कृत्रिम अंडाकार प्रणाली एक अधिक समान वातावरण प्रदान करती है और हैंडलिंग से अंडों को नुकसान की संभावना को कम करती है। शुक्रवार को ओविपोजीशन कप स्थापित करके, अधिकांश अंडाणु एक विशिष्ट कार्य सप्ताह के दौरान एकत्र किए गए थे, ताकि माइक्रोइंजेक्शन कार्य करने वालों के लाभ के लिए। हालांकि, इस विधि के लिए एक चेतावनी यह है कि 10% सुक्रोज समाधान आहार में पोषक तत्वों की कमी अंततः कीड़ों के स्वास्थ्य को प्रभावित करेगी, और कप में मादाएं आमतौर पर केवल 10 दिनों के बाद मरना शुरू कर देती हैं। अंडे की गुणवत्ता भी 6 दिनों के बाद गिरने लगती है, जैसा कि मृत या अस्वास्थ्यकर दिखने वाले अंडों में वृद्धि से स्पष्ट है। नतीजतन, माइक्रोइंजेक्शन के लिए उपयोग किए जाने वाले अंडों का चयनात्मक होना और 6 वें दिन के बाद मादाओं को नहीं रखना महत्वपूर्ण है।
उत्तरजीविता दर और आर्द्रता
माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के माध्यम से भ्रूण के अस्तित्व के लिए दो कारक महत्वपूर्ण प्रतीत होते हैं। मैडिस भ्रूण को संभालने का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू उन्हें अंडाकार माध्यम से हटाने के बाद और पूरे माइक्रोइंजेक्शन में डिसिकेटिंग से रोक रहा है। चूंकि अंडे आमतौर पर पौधे के ऊतकों के अंदर रखे जाते हैं, इसलिए उनमें निर्जलीकरण को रोकने के लिए पर्याप्त खोल की कमी होती है। यहां तक कि ह्यूमिडिफाइड हुड में भी निर्जलीकरण के कारण अंडों के पूरे सेट खो गए थे। हालांकि, अत्यधिक उच्च आर्द्रता माइक्रोइंजेक्शन को भी प्रभावित कर सकती है यदि पानी दो तरफा टेप पर या दायरे पर जमा होता है। दुर्भाग्य से, अंडे के निर्जलीकरण को आमतौर पर माइक्रोइंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान नोटिस करना आसान नहीं था, और वे अक्सर 2 या 3 दिनों बाद तक सामान्य दिखाई देते थे, जब वे पूरी तरह से पारदर्शी हो जाते थे, विकास के कोई संकेत नहीं दिखाते थे।
सुई की गुणवत्ता भी जीवित रहने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। अंडे को अनावश्यक नुकसान को कम करने के लिए सुई को लगाया जाना चाहिए। जब सुई अवरुद्ध हो जाती है, तो इंजेक्टर पर समाशोधन फ़ंक्शन का उपयोग करते हुए, धीरे से सुई की नोक को एक कम पेंटब्रश के साथ सहलाते हुए (चरण 4.7 देखें) आमतौर पर सुई को कार्यात्मक स्थिति में लौटा दिया जाता है। भले ही, प्रत्येक सुई में केवल थोड़ी मात्रा में इंजेक्शन समाधान (~ 0.25 μL) डालना और हर कुछ स्लाइड (~ 50-60 अंडे) में एक नई सुई पर स्विच करना यह सुनिश्चित करने के लिए अनुशंसित है कि इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान सुई की गुणवत्ता बनाए रखी जाए।
नॉकआउट फेनोटाइप की सफल पीढ़ी
रोगाणु कोशिकाओं को सफलतापूर्वक बदलने के लिए, भ्रूण माइक्रोइंजेक्शन आमतौर पर सेलुलराइजेशन से पहले जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए। कीट प्रजातियों के आधार पर, सूक्ष्म इंजेक्शन को पूरा करने के लिए समय की खिड़की केवल कुछ घंटों से लेकर पूरे दिन 14,15,20 तक होती है। यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि पी मेडिस भ्रूण सेलुलराइजेशन से कब गुजरते हैं। कैस 9-मध्यस्थता नॉकआउट का परीक्षण 4 घंटे के बाद अंडे के बाद (पेल) से 16 घंटे पेल तक के भ्रूण पर किया गया था, और सभी प्रयोगों में अपेक्षित फेनोटाइप देखे गए थे, यह सुझाव देते हुए कि सभी सूक्ष्म इंजेक्शन प्रीसेल्यूराइजेशन विंडो के भीतर किए गए थे।
आंख-रंग जीन, सफेद के पी. मेडिस ऑर्थोलॉग का चयन किया गया था क्योंकि नॉकआउट फेनोटाइप को इसकी सेल-स्वायत्त प्रकृति के कारण इंजेक्शन में स्क्रीन करना आसान होने की उम्मीद थी। दरअसल, जैसा कि अपेक्षित था, कैस 9 और गाइड आरएनए युक्त इंजेक्शन मिश्रण प्राप्त करने वाले भ्रूणों के बीच मोज़ेक और कुल नॉकआउट दोनों स्पष्ट रूप से पहचाने जाने योग्य थे। दुर्भाग्य से, पूर्ण नॉकआउट के साथ कोई इंजेक्शन नहीं लगाया गया था, और जीवित इंजेक्शनों का बड़े पैमाने पर संभोग सफेद आंखों वाली संतान उत्पन्न करने में विफल रहा। हालांकि, बाद में एक अलग जीन (क्लोबासा एट अल, प्रगति पर) को लक्षित करके एक उत्परिवर्ती रेखा सफलतापूर्वक उत्पन्न हुई। इससे पता चलता है कि सफेद उत्परिवर्ती रेखा स्थापित करने में विफलता या तो ऑफ-टारगेट प्रभावों (यानी, जीनोम में कहीं और महत्वपूर्ण क्षेत्रों को काटने) के कारण सबसे अधिक संभावना है, जो एक निकटता से जुड़े घातक उत्परिवर्तन उत्पन्न करती है, या पी मैडिस में सफेद के लिए एक अप्रत्याशित महत्वपूर्ण भूमिका है।
फेनोटाइपिक और आणविक डेटा (चित्रा 8 और चित्रा 9) पुष्टि करते हैं कि इंजेक्शन भ्रूण के नमूने में सफेद लोकस में एक महत्वपूर्ण नॉकआउट बनाया गया था, जिसके परिणामस्वरूप जीन फ़ंक्शन का कुल नुकसान होगा। इसके अलावा, जबकि सफेद में उत्परिवर्तन कुछ प्रजातियों में व्यवहार्य हैं, कम सफेद गतिविधि के हानिकारक होने की मिसाल है21,22। उस ने कहा, ऑफ-टारगेट प्रभावों को पूरी तरह से खारिज नहीं किया जा सकता है। संभावित ऑफ-टारगेट की भविष्यवाणी करने के लिए सटीक जीनोम अनुक्रम डेटा23 की आवश्यकता होती है, जो पी मैडिस में जीनोमिक संसाधनों की वर्तमान स्थिति इस समय करना असंभव बनाती है। भले ही, इन नए तरीकों के साथ, अन्य लक्ष्य जीनों का परीक्षण आत्मविश्वास से किया जा सकता है, यहां तक कि इस घातक कीट में नए आनुवंशिक उपकरण लाने के प्रयास में अधिक पारंपरिक ट्रांसजेनेसिस की ओर बढ़ना।
The authors have nothing to disclose.
नॉर्थ कैरोलिना स्टेट यूनिवर्सिटी, कीटविज्ञान और प्लांट पैथोलॉजी विभाग, डीएआरपीए के कीट सहयोगी कार्यक्रम का समर्थन करने वाली एक टीम का हिस्सा है। व्यक्त किए गए विचार, राय और / या निष्कर्ष लेखकों के हैं और उन्हें रक्षा विभाग या अमेरिकी सरकार के आधिकारिक विचारों या नीतियों का प्रतिनिधित्व करने के रूप में व्याख्या नहीं की जानी चाहिए। लेखक ों ने कोई प्रतिस्पर्धी हित घोषित नहीं किया है। एमडीएल, डीआर और एईडब्ल्यू ने परियोजना की कल्पना की और वित्त पोषण अधिग्रहण, परियोजना प्रशासन और संसाधन प्रदान किए। एफसी, डब्ल्यूके, एनजी और एमडीएल ने माइक्रोइंजेक्शन प्रयोगों की कल्पना और डिजाइन किया; ओएच ने अंडे देने की विधि की कल्पना और डिजाइन किया। एफसी और डब्ल्यूके ने प्रयोगों का प्रदर्शन किया; एफसी और डब्ल्यूके ने परिणामों का विश्लेषण किया; और एफसी, डब्ल्यूके, एनजी और एमडीएल ने पांडुलिपि लिखी। लेखक पी. मैडिस कॉलोनियों को बनाए रखने में उनकी मदद के लिए काइल सोज़ांस्की और विक्टोरिया बार्नेट को विशेष धन्यवाद देना चाहते हैं।
1 oz Containers | Dart | P100N | Adult container for egg-laying setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-103 | Serves as collection tube on vacuum aspirator setup |
15 mL Conical Tubes | Olympus | Genesee 28-106 | For making 10% sucorose solution and for holding adults when chilling before screening |
Aspirator | Bioquip | 1135A | For handling planthoppers |
Vacuum Aspirator | Fischer Technical | LAV-3 | Vacuum for aspirating larger numbers of insects |
Blue Spectrum LED Lights | Home Depot | GLP24FS/19W/LED | Grow lights for potted corn plants hoppers are feeding on |
Cas9 | TrueCut Cas9 Protein v2 | A36498 | Endonuclease for cutting planthopper genes |
Clear Vinyl Tubing | Home Depot | 3/8 in. I.D. x 1/2 in. O.D. x 10 ft. | Connects collection tube to pump on vacuum aspirator setup |
Corn planthoppers | North Carolina State University | N/A | Request from Dr. Anna Whitfield's lab |
Cotton balls | Genessee | 51-101 | Serves as a filter/insect catcher in collection tube on vacuum aspirator setup |
Double sided tape | Scotch Double Sided Tape | NA | Holding eggs for microinjection |
Early Sunglow corn | Park Seed Company | 05093-PK-N | Corn for rearing planthoppers |
epTIPS Microloader Tips | Eppendorf | C2554691 | Backfilling needle loading tips |
Femtojet Microinjection System | Eppendorf | 5247 | Controls injection pressure (12-20 psi, depending on needle bore size) |
Nutri-Fly Drosophila Agar | Genessee | 66-103 | Substrate for everything except egg-laying dish |
Fine forceps | Bioquip | 4731 | Egg handling |
General Purpose LE Agarose | Apex | 20-102 | Substrate inn egg-laying dish (oviposition medium) |
Guide RNA 1 – GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 2 – UCUGAAAUCACUGGCCAAUA | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Guide RNA 3 – GAGGGCAGAGUCGCUUUCUU | Synthego | CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1.5 nmol) | RNA guides for targeting planthopper white gene |
Humidifyer | Homedics | UHE-CM45 | For providing humidity in humidified hood |
Humidity chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | For holding injected embryos until hatching |
Insect rearing cages | Bioquip (special order) | Close to 1450 L (has plastic front and mesh fabric sides) | Cage for planthoppers on corn |
Laser-based Micropipiette Puller | Sutter Instruments | P-2000/G | For making injection needles / Heat = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160 |
Leica M165 FC Fluorescence Stereomicroscope | Leica | M165 FC | Planthopper screening |
Microinjection Scope | Leica | MZ12-5 | Microinjection scope outfited with an XY stage |
Micromanipulator | Narishige | MN-151 | For positioning microinjection needle |
Micropipette beveler | Sutter Instruments | FG-BV10-D | For beveling injection needles / Used 'fine' graded plate at 20° angle |
Microscope Stage | AmScope | GT100 X-Y Gliding Table | For positioning and moving embryos under microscope |
Miniature Paint Brush | Testor #2 8733 | Sold in 3 pack 281206 | Fine paintbrushes for embryo handling |
Needle Holder | Narishige | HI-7 | For holding the microinjection needle |
Percival Incubator | Percival | I41VLH3C8 | Rearing injectees until hatch |
Petri Dishes (100 x 15 mm) | VWR | 89038-968 | Making agar dish for egg-lay |
pGEM-T Easy Vector System I cloning kit | Promega | A1360 | Cloning Pm white target site |
Phenol Red | Sigma | 143-78-8 | Microinjection buffer |
Plain Microscope Slides or coverslip | Fisher Scientific | 12-549-3 | Hold eggs for microinjection |
Plasmid DNA Midi Kit | Zymo | D4200 | Purification of injection-ready plasmid DNAs |
Plastic paraffin film | Pechiney Plastic Packaging | PM-996 | Roll size 4 in. x 125 ft |
Plastic wrap | Glad ClingWrap Plastic Wrap | NA | Wrap the entire egg-laying chamber |
Primer – PmW CRISPR check F1 – AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R1 – GATTCCTCGCTGTTGGGT | IDT | 25 nmole DNA Oligo | First-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check F3 – TCACAGACCCTGGTGCTAATC | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Primer – PmW CRISPR check R3 – GTCCACAATCCACACTTCTGA | IDT | 25 nmole DNA Oligo | Second-round Primer for amplifing across target site within the Pm white gene |
Quartz capillaries | Sutter Instruments | QF100-50-10 | For making microinjection needles / O.D. 1 mm, I.D. 0.7 mm, 10 cm length |
Screen (White Organza Fabric) | Joann Fabrics | 16023889 | For covering the adult container |
Sparkleen | Fisher Scientific | 04-320-4 | Wash dishes |
Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | To make 10% sucorose solution |