Profilering av flyktiga föreningar i svartvinbärsfrukt med headspace solid fas mikroextraktion kopplad till gaskromatografi-masspektrometri
Summary
En headspace solid fas mikroextraction-gas-kromatografi plattform beskrivs här för snabb, pålitlig och halvautomatisk flyktig identifiering och kvantifiering i mogna svarta vinbärsfrukter. Denna teknik kan användas för att öka kunskapen om fruktarom och för att välja sorter med förbättrad smak för avel.
Abstract
Det finns ett ökande intresse för att mäta flyktiga organiska föreningar (VOC) som släpps ut av mogna frukter i syfte att odla sorter eller sorter med förbättrade organoleptiska egenskaper och därmed öka konsumenternas acceptans. Metabolomiska plattformar med hög genomströmning har nyligen utvecklats för att kvantifiera ett brett spektrum av metaboliter i olika växtvävnader, inklusive viktiga föreningar som ansvarar för fruktsmak och aromkvalitet (volatilomik). En metod som använder headspace solid fas mikroextraction (HS-SPME) i kombination med gaskromatografi-mas spektrometri (GC-MS) beskrivs här för identifiering och kvantifiering av VOC som släpps ut av mogna svarta vinbärsfrukter, en bär som är mycket uppskattad för sin smak och hälsofördelar.
Mogna frukter av svarta vinbärsväxter (Ribes nigrum) skördades och frystes direkt i flytande kväve. Efter vävnad homogenisering för att producera ett fint pulver tinades prover och blandades omedelbart med natriumkloridlösning. Efter centrifugering överfördes supernatanten till en headspace glasflaska som innehåller natriumklorid. VOC extraherades sedan med hjälp av en solid fas microextraction (SPME) fiber och en gas kromatograf kopplad till en jon fälla masspektrometer. Flyktig kvantifiering utfördes på de resulterande jonkromatogrammen genom att integrera topparealen, med hjälp av en specifik m/z-jon för varje VOC. Korrekt VOC-anteckning bekräftades genom att man jämförde retentionstider och masspektra av rena kommersiella standarder som körs under samma förhållanden som proverna. Mer än 60 flyktiga organiska föreningar identifierades i mogna svarta vinbärsfrukter som odlades på motsatta europeiska platser. Bland de identifierade flyktiga organiska föreningarna kan viktiga aromföreningar, såsom terpenoider och C6-flyktiga ämnen, användas som biomarkörer för svartvinbärsfruktkvalitet. Dessutom diskuteras fördelar och nackdelar med metoden, inklusive framtida förbättringar. Dessutom har användningen av kontroller för batchkorrigering och minimering av driftintensiteten betonats.
Introduction
Smak är ett viktigt kvalitetsdrag för alla frukter, vilket påverkar konsumenternas acceptans och därmed väsentligt påverkar säljbarheten. Smakuppfattningen innebär en kombination av smak- och luktsystem och beror kemiskt på närvaron och koncentrationen av ett brett spektrum av föreningar som ackumuleras i ätliga växtdelar, eller när det gäller flyktiga organiska föreningar, släpps ut av den mogna frukten1,2. Medan traditionell avel har fokuserat på agronomiska egenskaper som utbyte och skadedjursresistens, har fruktkvalitetsförädling, inklusive smak, länge försummats på grund av den genetiska komplexiteten och svårigheten att korrekt fenotypa dessa egenskaper, vilket leder till konsumenternas missnöje3,4. De senaste framstegen inom metabolomiska plattformar har varit framgångsrika när det gäller att identifiera och kvantifiera viktiga föreningar som ansvarar för fruktsmak och arom5,6,7,8. Dessutom möjliggör kombinationen av metabolitprofilering med genomiska eller transkriptomiska verktyg klargörandet av genetiken bakom fruktsmaken, vilket i sin tur kommer att hjälpa avelsprogram att utveckla nya sorter med förbättrade organoleptiska egenskaper2,4,9,10,11,12,13,14.
Svarta vinbär (Ribes nigrum) bär är mycket uppskattade för sina smak- och näringsegenskaper, som odlas i stor utsträckning över de tempererade zonerna i Europa, Asien och Nya Zeeland15. Merparten av produktionen sker för livsmedelsprodukter och drycker, som är mycket populära i Norden, främst på grund av bärens organoleptiska egenskaper. Fruktens intensiva färg och smak är resultatet av en kombination av antocyaniner, sockerarter, syror och FLYKT som finns i de mogna frukterna16,17,18. Analysen av svarta vinbärs flyktiga går tillbaka till 1960-talet19,20,21. På senare tid har flera studier fokuserat på svarta vinbär VOC, identifiera viktiga föreningar för frukt arom uppfattning och bedöma effekterna av genotyp, miljö, eller lagring och bearbetning villkor på VOC innehåll5,17,18,22,23.
På grund av dess många fördelar är den teknik som valts för flyktig profilering med hög genomströmning HS-SPME/GC-MS24,25. En kiseldioxidfiber, belagd med en polymerfas, är monterad på en sprutanordning, vilket möjliggör adsorption av flyktiga ämnen i fibern tills en jämviktsfas uppnås. Headspace extraktion skyddar fibern från de icke-volatila föreningarna som finns i matrisen24. SPME kan framgångsrikt isolera ett stort antal flyktiga organiska föreningar som förekommer vid mycket varierande koncentrationer (delar per miljard till delar per miljon)25. Dessutom är det en lösningsmedelsfri teknik som kräver begränsad provbehandling. Andra fördelar med HS-SPME är den enkla automatiseringen och dess relativt låga kostnad.
Dess framgång kan dock begränsas, beroende på voc:s kemiska karaktär, extraktionsprotokollet (inklusive tid, temperatur och saltkoncentration), provstabilitet och tillgången på tillräcklig fruktvävnad26,27. Detta dokument presenterar ett protokoll för svarta vinbär VOC isolerade av HS-SPME och analyseras av gas kromatografi i kombination med en jon fälla masspektrometer. En balans mellan mängden växtmaterial, provstabilitet och varaktigheten av extraktion och kromatografi uppnåddes för att kunna bearbeta ett stort antal svarta vinbärsprover, varav några presenterades i denna studie. Voc-profiler och/eller kromatogram av fem sorter (Andega”, “Ben Tron”, “Ben Gairn”, “Ben Tirran” och “Tihope”) kommer att presenteras och diskuteras som exempeldata. Dessutom har samma protokoll framgångsrikt omsatts i praktiken för VOC-mätning hos andra fruktbärsarter som jordgubb (Fragaria x ananassa), hallon (Rubusidaeus) och blåbär (Vaccinium spp.).
Protocol
Representative Results
Discussion
Uppfödning för fruktarom har länge hindrats av den komplexa genetik och biokemi som ligger till grund för syntesen av flyktiga föreningar och bristen på teknik för korrekt fenotypning. De senaste framstegen inom metabolomiska plattformar, i kombination med genomiska verktyg, gör det dock äntligen möjligt att identifiera de metaboliter som ansvarar för konsumenternas preferenser och att odla grödor med förbättrad smak3. Medan de flesta framsteg har gjorts i modellen frukt, <sup class=…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación från Universitetet i Malaga för HS-SPME/GC-MS mätningar. Vi erkänner hjälpen från Sara Fernández-Palacios Campos i den flyktiga kvantifieringen. Vi tackar också GoodBerrys konsortiemedlemmar för att de tillhandahåller fruktmaterialet.
Materials
| 10 mL screw top headspace vials | Thermo Scientific | 10-HSV | |
| 18 mm screw cap Silicone/PTFE | Thermo Scientific | 18-MSC | |
| 5 mL Tube with HDPE screw cap | VWR | 216-0153 | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75002415 | |
| Methanol for HPLC | Merck | 34860-1L-R | |
| N-pentadecane (D32, 98%) | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-1283-1 | |
| Sodium chloride | Merck | S9888 | |
| SPME fiber PDMS/DVB | Merck | 57345-U | |
| Stainless grinding jars for TissueLyser | Qiagen | 69985 | |
| TissueLyser II | Qiagen | 85300 | Can be subsituted by mortar and pestle or cryogenic mill |
| Trace GC gas chromatograph-ITQ900 ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Triplus RSH autosampler with automated SPME device | Thermo Scientific | 1R77010-0450 | |
| Water for HPLC | Merck | 270733-1L | |
| Xcalibur 4.2 SP1 | Thermo Scientific | software |
References
- Klee, H. J. Improving the flavor of fresh fruits: Genomics, biochemistry, and biotechnology. New Phytologist. 187 (1), 44-56 (2010).
- Ferrão, L. F. V., et al. Genome-wide association of volatiles reveals candidate loci for blueberry flavor. New Phytologist. 226 (6), 1725-1737 (2020).
- Klee, H. J., Tieman, D. M. The genetics of fruit flavour preferences. Nature Reviews Genetics. 19, 347-356 (2018).
- Vallarino, J. G., et al. Identification of quantitative trait loci and candidate genes for primary metabolite content in strawberry fruit. Horticulture Research. 6, 4 (2019).
- Jung, K., Fastowski, O., Poplacean, I., Engel, K. H. Analysis and sensory evaluation of volatile constituents of fresh blackcurrant (Ribes nigrum L.) fruits. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (43), 9475-9487 (2017).
- Vallarino, J. G., et al. Genetic diversity of strawberry germplasm using metabolomic biomarkers. Scientific Reports. 8, 14386 (2018).
- Zhang, W., et al. Insights into the major aroma-active compounds in clear red raspberry juice (Rubus idaeus L. cv. Heritage) by molecular sensory science approaches. Food Chemistry. 336, 127721 (2021).
- Farneti, B., et al. Exploring blueberry aroma complexity by chromatographic and direct-injection spectrometric techniques. Frontiers in Plant Science. 8, 617 (2017).
- Tikunov, Y., et al. The genetic and functional analysis of flavor in commercial tomato: the FLORAL4 gene underlies a QTL for floral aroma volatiles in tomato fruit. The Plant Journal. 103 (3), 1189-1204 (2020).
- Tieman, D., et al. A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science. 355 (6323), 391-394 (2017).
- Sánchez-Sevilla, J. F., Cruz-Rus, E., Valpuesta, V., Botella, M. A., Amaya, I. Deciphering gamma-decalactone biosynthesis in strawberry fruit using a combination of genetic mapping, RNA-Seq and eQTL analyses. BMC Genomics. 15, 218 (2014).
- Kumar, S., et al. Genome-wide scans reveal genetic architecture of apple flavour volatiles. Molecular Breeding. 35, 118 (2015).
- Bauchet, G., et al. Identification of major loci and genomic regions controlling acid and volatile content in tomato fruit: implications for flavor improvement. New Phytologist. 215 (2), 624-641 (2017).
- Sánchez, G., et al. An integrative ‘ omics’ approach identifies new candidate genes to impact aroma volatiles in peach fruit. BMC Genomics. 14, 343 (2013).
- Hummer, K. E., Dale, A. Horticulture of Ribes. Forest Pathology. 40 (3-4), 251-263 (2010).
- Vagiri, M., et al. Phenols and ascorbic acid in black currants (Ribes nigrum L.): Variation due to genotype, location, and year. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61 (39), 9298-9306 (2013).
- Marsol-Vall, A., Kortesniemi, M., Karhu, S. T., Kallio, H., Yang, B. Profiles of volatile compounds in blackcurrant (Ribes nigrum) cultivars with a special focus on the influence of growth latitude and weather conditions. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (28), 7485-7495 (2018).
- Varming, C., Petersen, M. A., Poll, L. Comparison of isolation methods for the determination of important aroma compounds in black currant (Ribes nigrum L.) juice, using nasal impact frequency profiling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 52 (6), 1647-1652 (2004).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants I. Higher boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 18, 1105-1114 (1964).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants. III. Chemical characterization of different varieties and stages of ripeness by gas chromatography. Acta Chemica Scandinavica. 20, 529-535 (1966).
- Andersson, J., von Sydow, E. The aroma of black currants II. Lower boiling compounds. Acta Chemica Scandinavica. 20, 522-528 (1966).
- Marsol-Vall, A., Laaksonen, O., Yang, B. Effects of processing and storage conditions on volatile composition and odor characteristics of blackcurrant (Ribes nigrum) juices. Food Chemistry. 293, 151-160 (2019).
- Del Castillo, M. L. R., Dobson, G. Varietal differences in terpene composition of blackcurrant (Ribes nigrum L) berries by solid phase microextraction/gas chromatography. Journal of the Science of Food and Agriculture. 82 (13), 1510-1515 (2002).
- Azzi-Achkouty, S., Estephan, N., Ouaini, N., Rutledge, D. N. Headspace solid-phase microextraction for wine volatile analysis. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 57 (10), 2009-2020 (2017).
- Vallarino, J. G., Antonio, C., et al. Acquisition of volatiles compounds by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Plant Metabolomics: Methods and Protocols. 1778, 225-239 (2018).
- Moreira, N., Lopes, P., Cabral, M., Guedes de Pinho, P. HS-SPME/GC-MS methodologies for the analysis of volatile compounds in cork material. European Food Research and Technology. 242, 457-466 (2016).
- Rambla, J. L., López-Gresa, M. P., Bellés, J. M., Granell, A., Alonso, J. M., Stepanova, A. N. Metabolomic profiling of plant tissues. Plant Functional Genomics and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1284, 221-235 (2015).
- Abbas, F., et al. Volatile terpenoids: multiple functions, biosynthesis, modulation and manipulation by genetic engineering. Planta. 246 (5), 803-816 (2017).
- Kolosova, N., Gorenstein, N., Kish, C. M., Dudareva, N. Regulation of circadian methyl benzoate emission in diurnally and nocturnally emitting plants. Plant Cell. 13 (10), 2333-2347 (2001).
- Dudareva, N., Pichersky, E., Gershenzon, J. Biochemistry of plant volatiles. Plant Physiology. 135 (4), 1893-1902 (2004).
- Borges, R. M., Ranganathan, Y., Krishnan, A., Ghara, M., Pramanik, G. When should fig fruit produce volatiles? Pattern in a ripening process. Acta Oecologica. 37 (6), 611-618 (2011).
- Jarret, D. A., et al. A transcript and metabolite atlas of blackcurrant fruit development highlights hormonal regulation and reveals the role of key transcription factors. Frontiers in Plant Science. 9, 1-22 (2018).
- Li, B., Lecourt, J., Bishop, G. Advances in non-destructive early assessment of fruit ripeness towards defining optimal time of harvest and yield prediction-a review. Plants. 7 (1), 3 (2018).
- Ul-Hassan, M. N., Zainal, Z., Ismail, I. Green leaf volatiles: Biosynthesis, biological functions and their applications in biotechnology. Plant Biotechnology Journal. 13 (6), 727-739 (2015).
- Gaston, A., Osorio, S., Denoyes, B., Rothan, C. Applying the Solanaceae strategies to strawberry crop improvement. Trends in Plant Science. 25 (2), 130-140 (2020).
- Gilbert, J. L., et al. Identifying breeding priorities for blueberry flavor using biochemical, sensory, and genotype by environment analyses. PLoS ONE. 10 (9), 0138494 (2015).
- Bueno, M., Resconi, V. C., Campo, M. M., Ferreira, V., Escudero, A. Development of a robust HS-SPME-GC-MS method for the analysis of solid food samples. Analysis of volatile compounds in fresh raw beef of differing lipid oxidation degrees. Food Chemistry. 281, 49-56 (2019).
- Burzynski-Chang, E. A., et al. HS-SPME-GC-MS analyses of volatiles in plant populations-quantitating compound × individual matrix effects. Molecules. 23 (10), 2436 (2018).
