Genomomfattende analyse av histone modifikasjoner Distribusjon ved hjelp av Chromatin Immunoprecipitation Sekvensering Metode i Magnaporthe oryzae

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å analysere den genomomfattende fordelingen av histone modifikasjoner, som kan identifisere nye målgener i patogenesen av M. oryzae og andre filamentøse sopp.

Abstract

Kromatinimmunoprecipitation sekvensering (ChIP-seq) er en kraftig og mye brukt molekylær teknikk for å kartlegge hele genomet steder av transkripsjonsfaktorer (TFer), kromatinregulatorer og histone modifikasjoner, samt oppdage hele genomer for å avdekke TF bindende mønstre og histone posttranslational modifikasjoner. Kromatinmodifiserende aktiviteter, som histone metylering, rekrutteres ofte til spesifikke genregulatoriske sekvenser, forårsaker lokaliserte endringer i kromatinstrukturer og resulterer i spesifikke transkripsjonseffekter. Risblåsingen er en ødeleggende soppsykdom på ris over hele verden og er et modellsystem for å studere soppplanteinteraksjon. Imidlertid forblir de molekylære mekanismene i hvordan histone modifikasjonene regulerer deres virulensgener i Magnaporthe oryzae unnvikende. Flere forskere må bruke ChIP-seq for å studere hvordan histone epigenetisk modifikasjon regulerer deres målgener. ChIP-seq er også mye brukt til å studere samspillet mellom protein og DNA hos dyr og planter, men det er mindre brukt innen plantepatologi og har ikke blitt godt utviklet. I dette dokumentet beskriver vi den eksperimentelle prosessen og operasjonsmetoden til ChIP-seq for å identifisere den genomomfattende fordelingen av histonmetylering (som H3K4me3) som binder seg til de funksjonelle målgenene i M. oryzae. Her presenterer vi en protokoll for å analysere den genomomfattende fordelingen av histone modifikasjoner, som kan identifisere nye målgener i patogenesen av M. oryzae og andre filamentøse sopp.

Introduction

Epigenetikk er en gren av genetisk forskning som refererer til arvelig endring av genuttrykk uten å endre nukleotidsekvensen av gener. Et økende antall studier har vist at epigenetisk regulering spiller en viktig rolle i veksten og utviklingen av eukaryote celler, inkludert kromatin som regulerer og påvirker genuttrykk gjennom den dynamiske prosessen med å brette og montere i høyere orden strukturer^1,2. Kromatin ombygging og kovalent histone modifikasjon påvirker og regulerer funksjonen og strukturen av kromatin gjennom variasjonen av kromatinpolymerer, og oppnår dermed funksjonen til å regulere genuttrykk^3,4,5,6. Posttranslasjonelle modifikasjoner av histon inkluderer acetylering, fosforylering, metylering, monoubiquitination, sumoylering og ADP ribosylering^7,8,9. Histone H3K4 metylering, spesielt trimetylering, er kartlagt til transkripsjonsstartsteder der det er knyttet til transkripsjonsreplikasjon, rekombinasjon, reparasjon og RNA-behandling i eukaryoter^10,11.

ChIP-seq-teknologi ble introdusert i 2007 og har blitt den eksperimentelle standarden for genomomfattende analyse av transkripsjonsregulering og epigenetiske^{mekanismer 12,13}. Denne metoden er egnet i genomomskalaen og for å innhente informasjon om interaksjon med histone eller transkripsjonsfaktor, inkludert DNA-segmenter av DNA-bindende proteiner. Eventuelle DNA-sekvenser krysskoblet til proteiner av interesse vil coprecipitate som en del av kromatinkomplekset. Ny generasjon sekvenseringsteknikker brukes også til å sekvensere 36-100 bp DNA, som deretter tilpasses det tilsvarende målgenomet.

I fytopatogeniske sopp har forskning nylig begynt å studere hvordan histone metyleringsmodifikasjoner regulerer deres målgener i prosessen med patogenitet. Noen tidligere studier viste at reguleringen av histone metylaserelaterte gener hovedsakelig gjenspeiles i genaktivering og katalysering av produksjonen av sekundære metabolitter (SM). MoSet1 er H3K4-metylase i M. oryzae. Knockout av dette genet resulterer i fullstendig sletting av H3K4me3 modifikasjon¹⁴. Sammenlignet med den ville stammen, er uttrykket av genet MoCEL7C i mutanten hemmet i CMC-indusert tilstand og i ikke-indusert tilstand (glukose eller cellobiose), økte uttrykket av MoCEL7C ¹⁵. I Fusarium graminearumkan KMT6 katalysere metyleringsmodifiseringen av H3K27me3, regulere den normale utviklingen av sopp og bidra til å regulere det “kryptiske genomet” som inneholder SM-genklyngen^16,17,18,19. I 2013 rapporterte Connolly at H3K9 og H3K27 metylering regulerer den patogene prosessen med sopp gjennom sekundære metabolitter og effektfaktorer som regulerer hemmingen av målgener²⁰. I Aspergilluser modifikasjonen av histoner H3K4me2 og H3K4me3 relatert til genaktivering og spiller en viktig rolle i å kontrollere kromatinnivåreguleringen av SM-genklynger²¹. I M. oryzaeer Tig1 (homolog til Tig1 i gjær og pattedyr) en HADC (histone deacetylase)²². Knockout av Tig1-genet fører til fullstendig tap av patogenitet og sporeproduksjonsevne i nullmutanten. Det er mer følsomt for et peroksygenmiljø, som ikke kan produsere infektiv hyphae²².

Riseksplosjonen forårsaket av M. oryzae. er en av de mest alvorlige rissykdommene i de fleste risvoksende områder i verden¹⁹. På grunn av sin representative infeksjonsprosess ligner M. oryzae infeksjonsprosessen til mange viktige patogene sopp. Som det lett kan utføre molekylære genetiske operasjoner, har soppen blitt en modellorganisme for å studere soppplanteinteraksjoner²³. Blokkering av hvert trinn i infeksjonsprosessen til M. oryzae kan føre til mislykket infeksjon. De morfologiske endringene under infeksjonsprosessen er strengt regulert av hele genomfunksjonen og gentranskripsjonen. Blant dem spiller epigenetiske modifikasjoner som histone metylering en viktig rolle i transkripsjonsreguleringen av funksjonelle gener^24,25. Men så langt har det blitt gjort få studier på den molekylære mekanismen for epigenetiske modifikasjoner som histonmetylering og histonacetylering i transkripsjonen av patogenesegener i M. oryzae. Derfor vil videreutvikling av den epigenetiske reguleringsmekanismen til risblåse soppen mens forskning på oppstrøms og nedstrøms regulatorisk nettverk av disse patogene relaterte genene bidra til å utvikle risblåseforebygging og kontrollstrategier.

Med utviklingen av funksjonell genomikk som ChIP-seq, spesielt i epigenetikk, har denne datainnsamlingsmetoden med høy gjennomstrømning akselerert forskning på kromosomer. Ved hjelp av ChIP-seq eksperimentell teknologi kan genom-wide distribusjon av histonmetylering (som H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) i M. oryzae og andre filamentøse sopp identifiseres. Derfor kan denne metoden bidra til å belyse de molekylære mekanismene som ligger til grunn for hvordan epigenetiske modifikasjoner regulerer deres kandidatmålgener under sopppatogenese i plantepatologi.

Protocol

1. Tilberedning av protoplaster fra M. oryzae Forbered havregryn-tomatagaren (OTA). Vei 30-50 g havregryn og kok det i 800 ml vann (ddH2O) i 20 min. Filtrer gjennom to lag gasbind og ta filtratet. Velg modne tomater og skrell dem. Klem saften, og filtrer gjennom to lag gasbind for å samle 150 ml av den filtrerte saften. Bland all tomatjuice og tilberedt havrefiltrat grundig og tilsett ddH2O opptil 1000 ml. Tilsett 250 ml OTA og 2,5 g agarp…

Representative Results

Hele flytskjemaet for ChIP-seq -metoden vises i figur 1. ChIP-seq eksperimenter ble utført ved hjelp av antistoffer mot H3K4me3 i wild-type stammen P131 og tre null mutant stammer som var blottet for mobre2, mospp1, og moswd2 genet for å verifisere hele genom-wide profilen av histone H3K4me3 distribusjon i M. oryzae. Protoplastene til den ville stammen, Δmobre2, Δmospp1og Δmoswd2, ble forberedt og sonikert ved 25% W, utgang …

Discussion

Nylig har ChIP-seq blitt en mye brukt genomisk analysemetode for å bestemme bindingsstedene til TFer eller berikelsessteder modifisert av spesifikke histoner. Sammenlignet med tidligere ChIP-seq-teknologi er ny ChIP-seq-teknologi svært følsom og fleksibel. Resultatene leveres i høy oppløsning uten negative effekter, for eksempel støysignalet forårsaket av ikke-spesifikk hybridisering av nukleinsyrer. Selv om dette er en vanlig genuttrykksanalyse, har mange beregningsmetoder blitt validert, og kompleksiteten til Ch…

Materials

acidic casein hydrolysate	WAKO	65072-00-6	Medium configuration
agar powder	scientan	9002-18-0	Medium configuration
deoxycholic acid	MedChemExpress	83-44-3	protein and dissolution
DNA End-Repair kit	NovoBiotec	ER81050	Repair DNA or cDNA damaged by enzymatic or mechanical shearing
Dynabeads	Invitrogen	no.100.02D	Binding target
EB buffer	JIMEI	JC2174	Membrane and liquid
EDTA	ThermoFisher	AM9912	protease inhibitor
enzymatic casein hydrolysate	Sigma	91079-40-2	Medium configuration
glucose	Sigma	50-99-7	Medium configuration
glycogen	ThermoFisher	AM9510	Precipitant action
H3K4me3 antibodies	Abcam	ab8580	Immune response to H3K4me3 protein
illumina Genome Analyzer	illumina	illumina Hiseq 2000	Large configuration
Illumina PCR primers	illumina	CleanPlex	Random universal primer
isoamyl alcohol	chemical book	30899-19-5	Purified DNA
LiCl	ThermoFisher	AM9480	specific removal RNA
lysing enzymes	Sigma	L1412-10G	cell lysis buffer
Mouse IgG	Yeasen	36111ES10	Animal normal immunoglobulin
NaCl solution	ThermoFisher	7647-14-5	Medium configuration
NaHCO3	Seebio	SH30173.08*	preparation of protein complex eluent
NP-40	ThermoFisher	85124	cell lysate to promote cell lysis
PCR Purification kit	Qiagen	28004	The purification procedure removes primers from DNA samples
protease inhibitors	ThermoFisher	A32965	A protein inhibitor that decreases protein activity
Proteinase K	ThermoFisher	AM2546	DNA Extraction Reagent
Qubit 4.0	ThermoFisher	Q33226	Medium configuration
RIPA buffer	ThermoFisher	9806S	cell lysis buffer
RNase A	ThermoFisher	AM2271	Purified DNA
SDS	ThermoFisher	AM9820	cover up the charge differences
sodium acetate solution	ThermoFisher	R1181	Acetic acid buffer
sodium deoxycholate	ThermoFisher	89904	inhibition of protease degradation
T4 DNA ligase	ThermoFisher	EL0011	Under the condition of ATP as coenzyme, DNA ligase
T4 DNA ligase buffer	ThermoFisher	B69	DNA ligase buffer
Tris-HCl	ThermoFisher	1185-53-1	buffer action
Triton X-100	ThermoFisher	HFH10	keep the membrane protein stable
yeast extract	OXOID	LP0021	Medium configuration