הכנת הומוגנטים של שרירי שלד חולדה למדידות חנקות וניטריט
Summary
אנו מציגים פרוטוקולים לשלוש שיטות שונות להומוגניזציה של ארבע קבוצות שרירים שונות של רקמת שריר שלד חולדה כדי למדוד ולהשוות את רמות החנקות והניטריט. יתר על כן, אנו משווים משקלים שונים של דגימות כדי לחקור אם גודל דגימת הרקמה משפיע על תוצאות ההומוגניזציה.
Abstract
יונים חנקתיים (NO3–) נחשבו בעבר לתוצרים סופיים אינרטיים של חילוף החומרים של תחמוצת החנקן (NO). עם זאת, מחקרים קודמים הראו כי יונים חנקתיים יכולים להיות מומרים בחזרה ל-NO ביונקים באמצעות מנגנון הפחתה דו-שלבי: ניטרט מופחת לניטריט (NO2-) בעיקר על ידי חיידקי קומנסל דרך הפה, ואז ניטריט מופחת ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל באמצעות חלבונים המכילים הם או מוליבדן. מסלול חנקתי רדוקטיבי זה תורם לשיפור מסלולי איתות ללא תיווך, במיוחד במערכת הלב וכלי הדם ובמהלך פעילות גופנית. רמות החנקות בגוף לפני ניצול כזה נקבעות על ידי שני מקורות שונים: חמצון NO אנדוגני וצריכת חנקות תזונתית, בעיקר מצמחים. כדי להבהיר את מחזור ה-NO המורכב בנסיבות פיזיולוגיות, בחנו עוד יותר את הדינמיקה של המטבוליטים, יוני החנקות והניטריטים שלו, שהם יציבים יחסית בהשוואה ל-NO. במחקרים קודמים זוהה שריר השלד כאיבר אחסון מרכזי ליוני חנקות ביונקים, וכן כמקור ישיר של NO במהלך פעילות גופנית. לכן, קביעת מתודולוגיה אמינה למדידת רמות החנקות והניטריטים בשרירי השלד חשובה ואמורה לסייע בהרחבת יישומה לדגימות רקמות אחרות. מאמר זה מסביר בפירוט את הכנת דגימות שרירי השלד, תוך שימוש בשלוש שיטות הומוגניות שונות, למדידות ניטראט וניטריט ודן בנושאים חשובים הקשורים לתהליכי הומוגניזציה, כולל גודל הדגימות. ריכוזי ניטראט וניטריט הושוו גם בארבע קבוצות שרירים שונות.
Introduction
תחמוצת החנקן (NO), מולקולת איתות גזית קטנה, ממלאת תפקיד קריטי בתהליכים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים1. לא ניתן לייצר NO מ-L-ארגינין על-ידי אנזימים אנדוגניים ממשפחת הסינתאז של תחמוצת החנקן (NOS) לפני שהוא עובר חמצון מהיר לחנקות (NO 3-) וייתכן שגם ניטריט (NO 2–) בדם וברקמות 2,3. לאחרונה הוכח כי אניונים אלה מופחתים בחזרה ל-NO במערכות יונקים4. חנקה מומרת לניטריט, בעיקר על ידי רדוקטזות של חיידקים חנקתיים בחלל הפה הפועלות על יונים המופרשים על ידי בלוטות הרוק ונבלעים ישירות 5, ובמידה מסוימת, על ידי אנזימים של יונקים כגון קסנטין אוקסידורדוקטאז 6,7. ניטריט יכול להיות מופחת עוד יותר ל-NO על ידי מספר מנגנונים, כולל דאוקסיהמוגלובין8, דאוקסימיוגלובין9, אנזימים המכילים מוליבדן 10, והפחתה לא אנזימטית בנוכחות פרוטונים11,12.
מסלול ניטריט-ניטריט-NO זה משופר בתנאים היפוקסיים שבהם פעילות ה-NOS פוחתת מכיוון ש-NOS דורש חמצן עבור NO דור4. מחקרים רבים שנערכו לאחרונה דיווחו על השפעות מועילות של חנקות תזונתיות על ויסות לחץ הדם ועל הביצועים הגופניים, מה שמצביע על כך שמסלולי הפחתת חנקות תורמים להגברת האיתות NO13,14,15. מחקרים קודמים הראו כי חלק משרירי השלד הם ככל הנראה מקומות אחסון החנקות העיקריים בגוף16. בהשוואה לדם או לאיברים פנימיים אחרים כגון כבד, שרירי השלד (gluteus maximus) מכילים רמות גבוהות משמעותית של חנקות ויש להם מסה משמעותית בגוף היונקים. הודגם כי תרגיל הליכון משפר את הפחתת החנקות לניטריט ול-NO בגלוטאוס בחולדה מדגם7. תוצאות אלה מרמזות על כך ששרירי שלד מסוימים עשויים להיות מקורות חשובים ל-NO באמצעות מסלולי הפחתת חנקות במצבים פיזיולוגיים. מחקרים עדכניים יותר מצביעים על כך שממצאים אלה, כולל שינויים ברמות החנקות בשרירים במהלך פעילות גופנית, מתרחשים גם בבני אדם17.
שניים מהמחברים הנוכחיים ביססו בעבר שיטה למדידת רמות חנקות וניטריט בדם ובדגימות נוזליות אחרות18. עם זאת, כאשר הרמות של אניונים אלה בהומוגנטים רקמה נותחו בתחילה, פרוטוקולים מפורטים לא היו זמינים. כדי להבין את הדינמיקה של ניטרט-ניטריט-NO בכמה איברים שונים, המטרה שלנו הייתה לפתח שיטה מדויקת ויעילה למדידת רמות החנקות והניטריטים ברקמות יונקים, כולל שרירי השלד. במחקרים קודמים, רקמות מכרסמים שימשו לפיתוח תהליכי הומוגניזציה אמינים ולאחר מכן לניתוח תכולת חנקות וניטריטים באותם הומוגנטים 7,16,19. השימוש בשיטת הומוגניזציה זו הורחב לדגימות ביופסיה של שרירי שלד אנושיים, לפיהן אושרו הערכים, וחשוב מכך, הערכים שנצפו עבור שריר בהשוואה לדם/פלזמה היו בטווחים ויחסים דומים לאלה שנצפו במכרסמים17. בשנים האחרונות, גם קבוצות אחרות החלו למדוד את רמות החנקות והניטריטים אצל הומוגנאטים בשרירי השלד, ודיווחו על ערכים דומים לאלה שדווחו על ידי הקבוצה שלנו20,21.
מטרת מאמר פרוטוקול זה היא לתאר בפירוט את הכנת הומוגנאטים בשרירי השלד באמצעות שלוש שיטות הומוגניזציה שונות למדידה עוקבת של רמות חנקות וניטריטים. בנוסף, נבדקו ההשפעות של משקל הרקמה המשמש להומוגניזציה על ערכים של חנקות וניטריט בדגימות שרירי השלד. אנו מאמינים כי ניתן ליישם שיטות אלה בקלות על סוגים אחרים של רקמות יונקים. לאחרונה, במיוחד בתחום הפיזיולוגיה של האימון, הוקדשה תשומת לב להבדלים האפשריים בפיזיולוגיה של ניטריט/ניטריט/NO בהתאם לקבוצות שרירים. אנו מדווחים גם על כמויות הניטראט והניטריט בארבעה שרירי מכרסמים שונים ומוצאים התפלגות לא אחידה של שני היונים בין השרירים השונים האלה; תצפית הדורשת מחקר נוסף.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לעקוב אחר שינויים במטבוליטים NO, חנקות וניטריט, כפונקציה של התערבויות פיזיולוגיות, זה הכרחי כדי למדוד את רמות יונים אלה באיברים השונים כי הם קריטיים בחילוף החומרים שלהם. כמו המוגלובין בדם יגיב עם NO ואת המטבוליטים שלה, חשוב גם להסיר את הדם במהירות מדגימות רקמות ככל האפשר. לפיכך, בעלי חיים…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH / NIDDK פנימי ZIA DK 0251041-14 לאלן נ שכטר, MD.
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
References
- Ignarro, L. J. Nitric oxide as a unique signaling molecule in the vascular system: a historical overview. Journal of Physiology and Pharmacology. 53 (4), 503-514 (2002).
- Moncada, S., Higgs, A. The L-arginine-nitric oxide pathway. New England Journal of Medicine. 329 (27), 2002-2012 (1993).
- Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. The biological lifetime of nitric oxide: implications for the perivascular dynamics of NO and O2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (1), 355-360 (2001).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (2), 156-167 (2008).
- Govoni, M., Jansson, E. A., Weitzberg, E., Lundberg, J. O. The increase in plasma nitrite after a dietary nitrate load is markedly attenuated by an antibacterial mouthwash. Nitric Oxide. 19 (4), 333-337 (2008).
- Jansson, E. A., et al. A mammalian functional nitrate reductase that regulates nitrite and nitric oxide homeostasis. Nature Chemical Biology. 4 (7), 411-417 (2008).
- Piknova, B., Park, J. W., Kwan Jeff Lam, K., Schechter, A. N. Nitrate as a source of nitrite and nitric oxide during exercise hyperemia in rat skeletal muscle. Nitric Oxide. 55-56, 54-61 (2016).
- Cosby, K., et al. Nitrite reduction to nitric oxide by deoxyhemoglobin vasodilates the human circulation. Nature Medicine. 9 (12), 1498-1505 (2003).
- Shiva, S., et al. Deoxymyoglobin is a nitrite reductase that generates nitric oxide and regulates mitochondrial respiration. Circulation Research. 100 (5), 654-661 (2007).
- Millar, T. M., et al. Xanthine oxidoreductase catalyses the reduction of nitrates and nitrite to nitric oxide under hypoxic conditions. FEBS Letter. 427 (2), 225-228 (1998).
- Benjamin, N., et al. Stomach NO synthesis. Nature. 368 (6471), 502 (1994).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Lundberg, J. M., Alving, K. Intragastric nitric oxide production in humans: measurements in expelled air. Gut. 35 (11), 1543-1546 (1994).
- Larsen, F. J., Ekblom, B., Sahlin, K., Lundberg, J. O., Weitzberg, E. Effects of dietary nitrate on blood pressure in healthy volunteers. New England Journal of Medicine. 355 (26), 2792-2793 (2006).
- Kapil, V., et al. Inorganic nitrate supplementation lowers blood pressure in humans: role for nitrite-derived NO. Hypertension. 56 (2), 274-281 (2010).
- Jones, A. M. Dietary nitrate supplementation and exercise performance. Sports Medicine. 44, 35-45 (2014).
- Piknova, B., et al. Skeletal muscle as an endogenous nitrate reservoir. Nitric Oxide. 47, 10-16 (2015).
- Wylie, L. J., et al. Human skeletal muscle nitrate store: influence of dietary nitrate supplementation and exercise. Journal of Physiology. 597 (23), 5565-5576 (2019).
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of nitrite in blood samples using the ferricyanide-based hemoglobin oxidation assay. Methods in Molecular Biology. 704, 39-56 (2011).
- Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. Journal of Visualized Experiments. (118), e54879 (2016).
- Nyakayiru, J., et al. Sodium nitrate ingestion increases skeletal muscle nitrate content in humans. Journal of Applied Physiology. 123 (3), 637-644 (2017).
- Troutman, A. D., Gallardo, E. J., Brown, M. B., Coggan, A. R. Measurement of nitrate and nitrite in biopsy-sized muscle samples using HPLC. Journal of Applied Physiology. 125 (5), 1475-1481 (2018).
- Shinin, V., Gayraud-Morel, B., Tajbakhsh, S. Template DNA-strand co-segregation and asymmetric cell division in skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 482, 295-317 (2009).
- Long, G. M., Troutman, A. D., Fisher, A., Brown, M. B., Coggan, A. R. Muscle fiber type differences in nitrate and nitrite storage and nitric oxide signaling in rats. bioRxiv. , (2020).
- Ohtake, K., et al. Dietary nitrite supplementation improves insulin resistance in type 2 diabetic KKA(y) mice. Nitric Oxide. 44, 31-38 (2015).
