用于硝酸盐和亚硝酸盐测量的大鼠骨骼肌匀浆的制备
Summary
我们提出了三种不同方法的方案，用于大鼠骨骼肌组织的四个不同肌肉群的均质化，以测量和比较硝酸盐和亚硝酸盐的水平。此外，我们比较不同的样品重量，以研究组织样品大小是否会影响均质化的结果。
Abstract
硝酸盐离子（NO3–）曾经被认为是一氧化氮（NO）代谢的惰性最终产物。然而，先前的研究表明，硝酸盐离子可以通过两步还原机制在哺乳动物中转化为NO：硝酸盐主要通过口服共生细菌还原为亚硝酸盐（NO2–），然后亚硝酸盐通过多种机制还原为NO，包括通过含血红素或钼的蛋白质。这种还原性硝酸盐途径有助于增强NO介导的信号通路，特别是在心血管系统和肌肉运动期间。在这种利用之前，体内硝酸盐的水平由两个不同的来源决定：内源性NO氧化和膳食硝酸盐摄入量，主要来自植物。为了阐明生理环境中复杂的NO循环，我们进一步研究了其代谢物，硝酸盐和亚硝酸盐离子的动力学，与NO相比，它们相对稳定。在以前的研究中，骨骼肌被确定为哺乳动物硝酸盐离子的主要储存器官，也是运动期间NO的直接来源。因此，建立一种可靠的方法来测量骨骼肌中的硝酸盐和亚硝酸盐水平非常重要，并且应该有助于将其应用扩展到其他组织样本。本文详细解释了使用三种不同的均质化方法制备骨骼肌样品，用于硝酸盐和亚硝酸盐测量，并讨论了与均质化过程相关的重要问题，包括样品的大小。硝酸盐和亚硝酸盐浓度也比较了四个不同的肌肉群。
Introduction
一氧化氮（NO）是一种小的气态信号分子，在生理和病理生理过程中起着关键作用1。NO可以通过一氧化氮合酶（NOS）家族的内源性酶从L-精氨酸产生，然后快速氧化为硝酸盐（NO 3-），并且可能在血液和组织中的亚硝酸盐（NO2–）2，3。最近，这些阴离子已被证明在哺乳动物系统中被还原回NO4。硝酸盐转化为亚硝酸盐，主要是通过口腔内共生细菌硝酸盐还原酶作用于唾液腺分泌的离子而直接摄入5，并在一定程度上通过哺乳动物酶如黄嘌呤氧化还原酶6，7。亚硝酸盐可以通过几种机制进一步还原为NO，包括脱氧血红蛋白8，脱氧肌红蛋白9，含钼酶10和质子存在下的非酶还原11，12。
这种硝酸盐 – 亚硝酸盐 – NO途径在缺氧条件下增强，其中NOS活性降低，因为NOS需要氧气才能产生NO4。最近的许多研究报告了膳食硝酸盐对血压调节和运动表现的有益影响，这表明硝酸盐减少途径有助于NO信号传导的增强13，14，15。先前的研究表明，一些骨骼肌可能是体内主要的硝酸盐储存场所16。与血液或其他内脏器官（如肝脏）相比，骨骼肌（臀大肌）含有更高水平的硝酸盐，并且在哺乳动物体内具有相当大的质量。在大鼠模型中，跑步机运动显示可增强硝酸盐减少到亚硝酸盐和臀大肌中的NO7。这些结果表明，一些骨骼肌可能是生理情况下通过硝酸盐减少途径获得NO的重要来源。最近的研究表明，这些发现，包括运动期间肌肉硝酸盐水平的变化，也发生在人类身上17。
目前的两位作者之前已经建立了一种测量血液和其他液体样品中硝酸盐和亚硝酸盐水平的方法18。然而，当最初分析组织匀浆中这些阴离子的水平时，没有详细的方案。为了了解几个不同器官中的硝酸盐-亚硝酸盐-NO动力学，我们的目标是开发一种准确有效的方法来测量哺乳动物组织（包括骨骼肌）中的硝酸盐和亚硝酸盐水平。在早期的研究中，啮齿动物组织用于开发可靠的均质过程，然后分析这些匀浆中的硝酸盐和亚硝酸盐含量7，16，19。这种均质化方法的使用扩展到人类骨骼肌活检样本，从而确认了这些值，重要的是，与血液/血浆相比，观察到的肌肉值与在啮齿动物中观察到的值相似17。近年来，其他小组也开始测量骨骼肌匀浆中的硝酸盐和亚硝酸盐水平，报告的值与我们小组20，21报告的数值相当。
本协议论文的目的是详细描述使用三种不同的匀浆方法制备骨骼肌匀浆，以便随后测量硝酸盐和亚硝酸盐水平。此外，还研究了用于均质化的组织重量对骨骼肌样品中硝酸盐和亚硝酸盐值的影响。我们相信这些方法可以很容易地应用于其他类型的哺乳动物组织。近年来，特别是在运动生理学领域，人们开始关注硝酸盐/亚硝酸盐/NO生理学根据肌肉群可能存在的差异。我们还报告了四种不同啮齿动物肌肉中硝酸盐和亚硝酸盐的含量，并发现这两种离子在这些不同的肌肉中分布不均匀;需要进一步研究的观察结果。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了监测NO代谢物，硝酸盐和亚硝酸盐的变化，作为生理干预的功能，必须测量这些离子在不同器官中的水平，这些离子在其代谢中至关重要。由于血液中的血红蛋白会与NO及其代谢物发生反应，因此尽可能从组织样本中快速去除血液也很重要。因此，在收集骨骼肌组织（臀肌，TA，EDL，腓肠肌）之前，用盐水灌注动物，并立即去除目标肌肉周围的结缔组织和脂肪。对于均质溶液，用铁氰化物、NEM …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了校内NIH / NIDDK授予医学博士Alan N Schechter的ZIA DK 0251041-14的支持。
Materials
| gentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| gentle MACS M tube | Miltenyi Biotec | 130-093-236 | Length: 87 mm; Diameter: 30 mm |
| Heparin Sodium | Hospira | NDC-0409-7620-13 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| Methanol | Sigma | 646377 | |
| Minilys bead homogenizer | Bertin Instruments | P000673-MLYS0-A | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| Nitric Oxide analyzer | GE | Sievers NOA 280i | |
| NP-40; 4-Nonylphenylpolyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| Potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| Precellys lysing kit | Bertin Instruments | P000911-LYSK0-A | contains 2 mL tubes with 2.8 mm ceramic (zirconium oxide) beads for homogenization |
| Pulverizer kit | Cellcrusher | Cellcrusher kit |
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