Cromatografia de exclusão de tamanho para analisar heterogeneidade vesícula de membrana externa bacteriana
Summary
As vesículas bacterianas desempenham papéis importantes na patogênese e têm aplicações biotecnológicas promissoras. A heterogeneidade das vesículas complica a análise e o uso; portanto, é necessário um método simples e reprodutível para separar diferentes tamanhos de vesículas. Aqui, demonstramos o uso da cromatografia de exclusão de tamanho para separar vesículas heterogêneas produzidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Abstract
A parede celular de bactérias Gram-negativas consiste em uma membrana interna (citoplasmática) e externa (OM), separada por uma fina camada peptidoglycan. Ao longo do crescimento, a membrana externa pode bleb para formar vesículas de membrana externa esférica (OMVs). Esses OMVs estão envolvidos em inúmeras funções celulares, incluindo entrega de carga para células hospedeiras e comunicação com células bacterianas. Recentemente, o potencial terapêutico dos OMVs começou a ser explorado, incluindo seu uso como vacinas e veículos de entrega de medicamentos. Embora os OMVs sejam derivados do OM, há muito se aprecia que a carga lipídica e proteica do OMV difere, muitas vezes significativamente, da do OM. Mais recentemente, evidências de que as bactérias podem liberar vários tipos de OMVs foram descobertas, e existem evidências de que o tamanho pode impactar o mecanismo de sua absorção por células hospedeiras. No entanto, os estudos nessa área são limitados por dificuldades em separar eficientemente os OMVs de tamanho heterogêneo. A centrifugação de gradiente de densidade (DGC) tem sido tradicionalmente utilizada para este fim; no entanto, essa técnica é demorada e difícil de escalar. A cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), por outro lado, é menos complicada e se presta à escala futura necessária para o uso terapêutico de OMVs. Aqui, descrevemos uma abordagem SEC que permite a separação reprodutível de vesículas de tamanho heterogêneo, usando como um caso de teste, OMVs produzidos por Aggregatibacter actinomycetemcomitans, que variam em diâmetro de menos de 150 nm a mais de 350 nm. Demonstramos separação de OMVs “grandes” (350 nm) e OMVs “pequenos” (<150 nm), verificados por dispersão dinâmica de luz (DLS). Recomendamos técnicas baseadas em SEC sobre técnicas baseadas em DGC para separação de vesículas heterogêneas devido à sua facilidade de uso, reprodutibilidade (incluindo usuário-para-usuário) e possibilidade de dimensionamento.
Introduction
Bactérias gram-negativas liberam vesículas derivadas de sua membrana externa, as chamadas vesículas de membrana externa (OMVs), durante todo o crescimento. Esses OMVs desempenham papéis importantes na comunicação célula-celular, tanto entre bactérias quanto hospedeiras, bem como entre células bacterianas, carregando uma série de biomoléculas importantes, incluindo DNA/RNA, proteínas, lipídios e peptidoglycans1,2. Em particular, o papel dos OMVs na patogênese bacteriana tem sido extensivamente estudado devido ao seu enriquecimento em certos fatores de virulência e toxinas3,4,5,6,7,8,9,10,11.
Os OMVs têm sido relatados de tamanho de 20 a 450 nm, dependendo das bactérias parentais e do estágio de crescimento, com vários tipos de bactérias liberando OMVs heterogêneas de tamanho heterogêneo8,12,13,14, que também diferem em sua composição proteica e mecanismo de entrada de células hospedeiras12. H. pylori liberou OMVs variando em diâmetro de 20 a 450 nm, com os OMVs menores contendo uma composição proteica mais homogênea do que os OMVs maiores. É importante ressaltar que as duas populações de OMVs foram observadas como internalizadas pelas células hospedeiras através de diferentes mecanismos12. Além disso, demonstramos que a Aggregatibacter actinomycetemcomitans libera uma população de pequenos OMVs (350 nm) OMVs, com os OMVs contendo uma quantidade significativa de uma toxina proteica secretada, leukotoxina (LtxA)15. Embora o papel da heterogeneidade do OMV nos processos celulares seja claramente importante, as dificuldades técnicas na separação e análise de populações distintas de vesículas limitaram esses estudos.
Além de sua importância na patogênese bacteriana, os OMVs têm sido propostos para uso em diversas aplicações biotecnológicas, incluindo como vacinas e veículos de entrega de medicamentos16,17,18,19,20. Para seu uso translacional em tais abordagens, é necessária uma preparação limpa e monodispersa de vesículas. Assim, são necessários métodos eficazes e eficientes de separação.
Mais comumente, a centrífugação gradiente de densidade (DGC) é usada para separar populações de vesículas heterogêneas de detritos celulares, incluindo flagelae e proteínas secretadas21; o método também tem sido relatado como uma abordagem para separar subpopulações OMV de tamanho heterogêneo12,13,14. No entanto, o DGC é demorado, ineficiente e altamente variável de usuário para usuário22 e, portanto, não é ideal para scale-up. Em contraste, a cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) representa uma abordagem escalável, eficiente e consistente para purificar os OMVs21,23,24. Descobrimos que uma longa (50 cm), fluxo de gravidade, coluna SEC, preenchida com meio de filtragem de gel é suficiente para purificar e separar eficientemente subpopulações de OMVs. Especificamente, usamos essa abordagem para separar os OMVs A. actinomycetemcomitans em subpopulações “grandes” e “pequenas”, bem como para remover a contaminação de proteínas e DNA. A purificação foi concluída em menos de 4h, e foi realizada a separação completa das subpopulações OMV e a remoção dos detritos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, fornecemos um protocolo para a separação simples, rápida e reprodutível das subpopulações bacterianas OMV. Embora a técnica seja relativamente direta, existem alguns passos que devem ser realizados com muito cuidado para garantir que ocorra uma separação eficiente na coluna. Primeiro, é essencial que o gel seja carregado na coluna com cuidado e lentamente para evitar bolhas de ar. Observamos que deixar o gel em temperatura ambiente por várias horas antes de carregar a coluna permite que o gel se equilibr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciência (1554417) e Institutos Nacionais de Saúde (DE027769).
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
References
- Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
- Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
- Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
- Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
- Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
- Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
- Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
- Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
- Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
- Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
- Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
- Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
- Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
- Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
- Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
- Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
- Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).
