Storlek exkludering kromatografi för att analysera bakteriell yttre membran vesikel heterogenitet
Summary
Bakteriella vesiklar spelar viktiga roller i patogenes och har lovande biotekniska tillämpningar. Andebandens heterogenitet komplicerar analys och användning; Därför är en enkel, reproducerbar metod för att separera olika storlekar av blåsor nödvändig. Här visar vi användningen av storlek exkludering kromatografi för att separera heterogena vesiklar produceras av Aggregatibacter actinomycetemcomitans.
Abstract
Cellväggen av gramnegativa bakterier består av ett inre (cytoplasmiskt) och yttre membran (OM), separerat av ett tunt peptidoglykanskikt. Under hela tillväxten kan det yttre membranet bleb för att bilda sfäriska yttre membran vesiklar (OMV). Dessa OMV är involverade i många cellulära funktioner inklusive lastleverans till värdceller och kommunikation med bakterieceller. Nyligen har den terapeutiska potentialen hos OMV börjat utforskas, inklusive deras användning som vacciner och läkemedelsleveransfordon. Även om OMVs härleds från OM, har det länge uppskattats att lipid- och proteinlasten i OMV skiljer sig, ofta avsevärt, från OM. På senare tid har bevis för att bakterier kan släppa ut flera typer av OMV upptäckts, och det finns bevis för att storleken kan påverka mekanismen för deras upptag av värdceller. Studier på detta område begränsas dock av svårigheter att effektivt separera de heterogent stora omständliga oms. Densitetsgradientcentrifugation (DGC) har traditionellt använts för detta ändamål. Denna teknik är dock tidskrävande och svår att skala upp. Storleksuteslutning kromatografi (SEC), å andra sidan, är mindre besvärlig och lämpar sig för den nödvändiga framtida uppskalningen för terapeutisk användning av OMV. Här beskriver vi en SEC-metod som möjliggör reproducerbar separation av heterogent stora vesiklar, med hjälp av omvar som testfall som produceras av Aggregatibacter actinomycetemcomitans, som sträcker sig i diameter från mindre än 150 nm till större än 350 nm. Vi visar separation av “stora” (350 nm) OMV och “små” (<150 nm) OMV, verifierade av dynamisk ljusspridning (DLS). Vi rekommenderar SEC-baserade tekniker över DGC-baserade tekniker för separation av heterogent stora vesiklar på grund av dess användarvänlighet, reproducerbarhet (inklusive användar-till-användare) och möjlighet till uppskalning.
Introduction
Gramnegativa bakterier frigör blåsor som härrör från deras yttre membran, så kallade yttre membran vesiklar (OMV), under hela tillväxten. Dessa OMV spelar viktiga roller i cell-till-cell-kommunikation, både mellan bakterier och värdar samt mellan bakterieceller, genom att bära ett antal viktiga biomolekyler, inklusive DNA / RNA, proteiner, lipider och peptidoglykaner1,2. I synnerhet har omvs roll i bakteriell patogenes studerats utförligt på grund av deras berikning i vissa virulensfaktorer och toxiner3,4,5,6,7,8,9,10,11.
OMV har rapporterats variera i storlek från 20 till 450 nm, beroende på moderbakterierna och tillväxtstadiet, med flera typer av bakterier som frigör heterogent stora OMV8,12,13,14, som också skiljer sig åt i deras proteinsammansättning och mekanism för värdcellinmatning12. H. pylori släppte OMV i diameter från 20 till 450 nm, med de mindre OMV som innehåller en mer homogen proteinsammansättning än de större OMV. Viktigt, de två populationerna av OMV observerades att internaliseras av värdceller via olika mekanismer12. Dessutom har vi visat att Aggregatibacter actinomycetemcomitans släpper ut en population av små (350 nm) OMV, med OMV som innehåller en betydande mängd ett utsöndrat proteintoxin, leukotoxin (LtxA)15. Medan rollen av OMV heterogenitet i cellulära processer är klart viktigt, tekniska svårigheter att separera och analysera distinkta populationer av vesiklar har begränsat dessa studier.
Förutom deras betydelse för bakteriell patogenes har OMV föreslagits för användning i ett antal biotekniska tillämpningar, inklusive som vacciner och läkemedelsleveransfordon16,17,18,19,20. För deras translationella användning i sådana metoder krävs en ren och monodisperse beredning av vesiklar. Således är effektiva och effektiva metoder för separation nödvändiga.
Oftast används densitetsgradientcentrifugation (DGC) för att separera heterogent stora vesikelpopulationer från cellulärt skräp, inklusive flagella och utsöndradeproteiner 21; Metoden har också rapporterats som ett tillvägagångssätt för att separera omv-delpopulationer av heterogent storlek12,13,14. DGC är dock tidskrävande, ineffektivt och mycket variabelt från användare till användare22 och är därför inte idealiskt för uppskalning. Däremot representerar storleksuteslutningskromatografi (SEC) en skalbar, effektiv och konsekvent metod för att rena OMV21,23,24. Vi har funnit att en lång (50 cm), gravitationsflöde, SEC-kolumn, fylld med gelfiltreringsmedium är tillräcklig för att effektivt rena och separera subpopulationer av OMV. Specifikt använde vi detta tillvägagångssätt för att separera A. actinomycetemcomitans OMV i “stora” och “små” subpopulationer, samt för att ta bort protein och DNA-förorening. Rening slutfördes på mindre än 4 h, och fullständig separation av OMV subpopulations och avlägsnande av skräp uppnåddes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här har vi tillhandahållit ett protokoll för enkel, snabb och reproducerbar separation av bakteriella OMV-subpopulationer. Även om tekniken är relativt rak, finns det några steg som måste utföras extremt noggrant för att säkerställa att effektiv separation sker i kolumnen. Först är det viktigt att gelén laddas in i kolonnen noggrant och långsamt för att undvika luftbubblor. Vi har observerat att lämna gelén vid rumstemperatur i flera timmar innan du laddar kolonnen gör att gelén kan jämvikta och mini…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av National Science Foundation (1554417) och National Institutes of Health (DE027769).
Materials
| 1-Step Ultra TMB-ELISA | Thermo Scientific | 34028 | |
| Amicon 50 kDa filters | Millipore Sigma | UFC905024 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9704-100 | |
| ELISA Immuno Plates | Thermo Scientific | 442404 | |
| FM 4-64 | Thermo Scientific | T13320 | 1.5 x 50 cm |
| Glass Econo-Column | BioRad | 7371552 | |
| Infinite 200 Pro Plate Reader | Tecan | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Amresco (VWR) | 0395-500G | |
| Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4) | Amresco (VWR) | 0781-500G | |
| Sephacryl S-1000 Superfine | GE Healthcare | 17-0476-01 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Amresco (VWR) | 0404-500G | |
| Tris Base | VWR | 0497-1KG | |
| Tween(R) 20 | Acros Organics | 23336-2500 |
References
- Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
- Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
- Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
- Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
- Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
- Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
- Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
- Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
- Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
- Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466 (2018).
- Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
- Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
- Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414 (2018).
- Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
- Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
- Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
- Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
- Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
- Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297 (2017).
- Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
- Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
- Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
- Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731 (2017).
- Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).
