여기서 우리는 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리 된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 급속한 동결 후에 초박단면도를 위한 견본을 준비하는 방법을 보여줍니다.
화학 적 고정은 세포와 조직의 초구조를 관찰하는 데 사용되었습니다. 그러나, 이 방법은 세포의 초구조를 적절히 보존하지 못한다; 유물 및 셀 내용물의 추출은 일반적으로 관찰됩니다. 급속 동결은 세포 구조의 보존을 위한 더 나은 대안입니다. 살아있는 효모 또는 박테리아의 샌드위치 동결은 동결 대체에 선행되어 세포의 절묘한 자연 초구조를 관찰하는 데 사용되어 왔다. 최근에는 글루타랄데히드-고정 배양 세포 또는 인간 조직의 샌드위치 동결도 세포 및 조직의 초구조를 드러내는 데 사용되어 왔다.
이러한 연구는 지금까지 수제 샌드위치 동결 장치로 수행되었으며 다른 실험실에서 의 연구에 대한 응용 프로그램이 제한되었습니다. 새로운 샌드위치 동결 장치는 최근에 제작되었으며 현재 상용화되었습니다. 본 논문은 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 샌드위치 동결 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 급속동결, 수지 포함, 블록 트리밍, 초박형 섹션 절단, 섹션 복구, 스테인링 및 지지 필름으로 그리드의 덮개를 위한 신속한 동결 및 절차 후 초박형 단면에 대한 시편의 준비도 도시되어 있다.
전자 현미경 검사는 세포 초구조를 연구하기위한 강력한 도구입니다. 종래의 탈수 절차로 화학적 고정은 세포와 조직의 초구조를 관찰하는 데 사용되어 왔다. 그러나, 이 방법은 세포의 초구조를 적절히 보존하지 않으며, 유물및 세포 내용물의 추출은 일반적으로 관찰된다. 세포와 조직의 신속한 동결 및 동결 대체는 세포 구조의 보존을 위한 더 나은 대안입니다.
3가지 주요 방법은 급속하게 세포를 동결하기 위해 사용되어왔다 1: 1) 플런지 동결은 프로판과 같은 냉각 된 극저온물질로 표본을 급락시킴으로써 수행되고, 1950년대 초부터 사용되었다2; 2) 차가운 금속 블록 동결은 액체 질소 또는 액체 헬륨3,4로냉각 된 금속 블록에 세포 와 조직을 빠르게 슬래밍하여 수행됩니다. 및 3) 고압 동결은 고압5,6,7하에서액체 질소를 가진 세포 및 조직을 동결시킴으로써 수행된다.
샌드위치 동결은 두 개의 구리 디스크 사이에 얇은 생물학적 물질을 끼워 액체 프로판8,9,10으로급락하여 빠르게 동결하여 수행 되는 플런지 동결의 일종이다. 이 방법에서는 매우 얇은 시편(몇 마이크로미터 두께)이 양쪽에서 열전도율이 좋은 금속을 사용하여 극저온으로 빠르게 냉각됩니다. 따라서, 이 방법은 효과적으로 시편에서 열을 제거하여 얼음 결정 손상없이 세포를 안정적으로 동결할 수 있게 합니다. 샌드위치 동결, 살아있는 효모 및 세균 세포의 동결 대체에 이어, 세포10,11,12,13, 14,15,16의자연적인 초구조를 드러낸다.
최근에는 글루타랄데히드 고정 미생물17,18,19,20,21,22,23, 24,배양세포25,26,27,인간 세포 및 조직1,28의 명확한 세포 이미지를 보존하는 데 유용한 것으로밝혀졌습니다. . 이러한 연구는 수제 샌드위치 동결장치(29)를이용하여 수행되고 있으며, 다른 실험실에서 다른 연구에 대한 응용 프로그램이 제한되어 있지만, 새로운 샌드위치 동결 장치(SFD)가28을 조작하여 현재 상용화되었습니다.
본 논문은 박테리아, 효모, 배양 세포, 분리된 세포, 동물 및 인간 조직 및 바이러스를 포함한 생물학적 표본의 신속한 동결을 위해 SFD를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한 급속동결 후 초박형 단면에 대한 시편의 준비뿐만 아니라 동결 대체, 수지 포함, 블록 트리밍, 초박형 섹션 절단, 섹션 복구, 얼룩 및 지지 필름으로 그리드 덮개를 위한 절차가 표시됩니다.
다음 토론은 36년 동안 실시된 75개 이상의 샘플에 대한 1,000개 이상의 샘플과 70개 이상의 플런지 동결-냉동 전자 현미경 실험에 대한 120개 이상의 샌드위치 동결 동결 대체 실험을 기반으로 합니다.
샌드위치 동결에 의해 좋은 동결에 대한 성공률
좋은 동결을 달성하는 성공률은 샘플에 따라 달라집니다. YPD 배지(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 덱스트로스 2%)에서 배양된 사카로미세스 세레비시아(효모) 세포는 얼음 결정 형성 10,11,15,35,36없이 좋은 동결을 위해 거의100%성공을 거두었다. 기타 효모종은 시조사카로미세스(37),38,39,크립토코커스14개,40개,41개,42개,43종,44종,45종, 엑소피알라13,41, 46,47,48종, 49, 푸사리움50,51,52, 아우레로바시듐53, 칸디다54,55, 펠로미세스56, 아스퍼길러스57, 트리코스포론도 좋은 동결을 보였다. 진균균58,59 및 대장균16을포함한 박테리아도 좋은 동결을 보였다. 배양된 세포와 분리된 동물 세포는 살아있는 세포와 글루타랄데히드 고정 세포1,25, 26,27,60모두에 좋은 동결을 보였다. 글루타랄데히드-고정 된 동물 및 인간 조직 0.1 ~ 0.2 mm 두께또한 대부분의 시간1,28에좋은 동결을 보였다.
좋은 동결을위한 조건
적절한 성장 단계와 조건에서 세포만 사용하십시오. 배양에 있는 세포는 기하급수적인 단계에 있어야 합니다. 구리 디스크에 농축 된 샘플의 매우 적은 양의 세포 현탁액 (S. cerevisiae,~ 0.02 μL의 3-5 × 109 셀 / mL)을 적용하십시오. 동물 또는 인간 조직의 글루타랄데히드 고정 조각은 또한 매우 작아야 합니다 (바람직하게는 0.3 mm x 0.3 mm x 0.1 mm). 0.1mm 두께의 티슈 슬라이스를 자르는 것은 어렵기 때문에 많은 조직을 슬라이스하고 얇고 반 투명한 슬라이스를 선택합니다. 신속 하 게 하 고 신중 하 게 작업 하 고 샘플 건조 하지 않습니다. 핀셋으로 쌓인 구리 디스크를 집어 들때, 세포와 조직을 분쇄하지 않도록 디스크를 너무 세게 누르지 마십시오. 시편 하중은 성공적인 동결을 위한 가장 중요한 단계이며, 필요한 조건은 고압 동결을 위한 양호한 동결조건과 동일합니다. 독자는 맥도날드에 의해 우수한 리뷰를 참조해야61.
기타 응용 프로그램
이 논문은 박테리아, 효모, 배양 세포, 고립 된 동물 세포, 인간 조직 및 바이러스 입자의 전자 현미경 그래프를 제시합니다. 우리는 글루타랄데히드 고정 해양 조류의 좋은 동결을 관찰했다. 그러나, 살아있는 민물 녹조류의 세포 구조는 얼음 결정 형성에 의해 파괴되었다. 20% 소 세럼 알부민(BSA)과 세포를 혼합하면 초구조가 얼음 결정 손상 없이 잘 보존되도록 했습니다. 20%의 BSA를 사용하면 버섯 줄기 세포의 초구조를 보존하는 데에도 도움이 되었습니다. 20%의 BSA를 적용하여 식물 세포 및 조직의 동결에 대한 실험이 진행 중이다. 샌드위치 동결-동결 대체 시료의 주사 전자 현미경 검사는 시도되지 않았지만, 잘 보존된 세포 구조의 관찰은 이전에보고되었다 9.
샌드위치 동결 방법에 대한 참고 사항
세포의 가까운 네이티브 울트라 구조는 살아있는 세포의 급속한 동결 및 동결 대체에 의해 관찰되는 것이 가장 좋습니다. SFD를 가진 얼음 결정 형성은 세포의 두께를 ≤30 μm1로제한함으로써 피할 수 있다. 글루타랄데히드로 조직을 고정하는 것은 종종 현탁액 배양 세포를 관찰하기 위한 세포 구조를 더 잘 보존하는 데 수반되는데, 글루타랄데히드 고정은 세포 구조를 보다 경직시키고 살아있는 세포의 수집 및 원심분리 시 가능한 초구조적 변화를 방지하기때문이다. 글루타랄데히드 고정은 또한 고압 동결(HPF) 방법에 의해 달성된 것과 유사한 0.2 mm1까지동결 깊이의 연장을 허용한다. 따라서, HPF 기계는 동물과 인간 조직의 깊은 동결을 위해 SFD로 대체될 수 있다.
글루타랄데히드 고정 조직은28년이상 보관할 수 있기 때문에 사용자의 편의에 따라 샌드위치 동결을 수행할 수 있습니다. 글루타랄데히드로 조직을 고정하면 조직이 고정되어 있기 때문에 조직 단면이 촉진됩니다. HPF 기계와는 달리, SFD는 극저온 전자 현미경 검사법과 박테리아 및 진핵 세포에 대한 바이러스의 신속한 동결에 사용될 수 있습니다. 또한 HPF 기계에 비해 SFD는 작고 휴대성이 뛰어나며 비용이 적게 들며 더 많은 실험실에서 획득할 수 있습니다. 우리는 SFD의 이러한 기능이 더 많은 실험실이 연구 목표28을달성하는 데 도움이되기를 바랍니다.
세포의 자연적인 형태의 특징
세포 구조는 외부 멤브레인(도12A,B),플라즈마 멤브레인(도12B,C)의 막 구조와 같은 외관을 보이면 자연 상태에있다. 그림 13A–D; 도 14E),핵봉투(도 12C, 도 13B-D및 도 14D-E),미토콘드리아(도12C, 도 13C,및 도 14D),및 바쿠올레(도12C)가매끄러운 윤곽을 보여준다. 핵과 바쿠올은 거의 원형이다(도12C). 리보솜은 ~20nm의 직경을 가진 맑은 전자 조밀한 외관을 보여줍니다(도 12B,C; 도 13C; 및 그림 14D). 세포질은 전자 루센트(도12B,C; 도 13C; 및 그림 14D).
세포 형태에 대한 글루타랄데히드 고정의 효과
글루타랄데히드 고정은 얼음 수정이 없는 울트라 구조를 얻기 위해 동결하기 전에 동물 또는 인간 조직을 위해 수행되었다. 이 방법에 의해 얻은 현미경 사진은 살아있는 조직의 급속한 동결에 의해 얻어진 것과 유사한 정교하게 선명한 심상을 보여줍니다(도 14)1. 효모 세포, 심해 미생물 및 배양 세포에 대한 연구는 초구조구조의 변형이 주로 실온1,17,18, 28에서에탄올에 의한 오스뮴 테트옥사이드 고정 및 탈수에 기인한다는 것을 보여준다. 스몰은 또한 글루타랄데히드 고정이 배양된 섬유아세포, 아세톤 또는 에탄올에 의한 오스뮴 테트옥사이드 고정 및 탈수의 액틴 조직을 파괴하지는 않지만 액틴조직(62)을파괴한다고 보고했다.
따라서 세포 형태에 대한 글루타랄데히드 고정의 효과에 대한 자세한 연구가 수행되어야합니다. 오노(Ohno)는혈액공급(63)을멈추지 않고 살아있는 조직이 급속히 동결되는 생체내 저온법을 개발하였다. 조직은 동결 대용품및 에폭시 수지에 내장되었고, 초박형 단면도가 관찰되었다. 전자 현미경 이미지는 화학 고정 -기존의 탈수및 신선한 고정되지 않은 조직의 급속한 동결에 의해 얻은 것과 비교하여 살아있는 조직의 가장 가까운 네이티브 울트라 구조를 보여 주었다. 따라서 글루타랄데히드 고정-동결 대체(본 방법)에 의해 얻어진 초구조를 비교하는 것이 재미있을 수 있으며, 생체 내 극저온 동결 대체체에 의해 글루타랄데히드 고정의 효과를 검사하는 것이 흥미로울 수 있다.
환경에 대한 고려 및 실험 효율성 향상
수지의 대체를 위해 2mL 플라스틱 튜브를 사용합니다. 희석 된 수지의 1 mL은 각 대체 단계에 충분합니다. 사용된 플라스틱 튜브는 각 실험 후에 폐기될 수 있다. 이것은 수지 대체에 사용될 때 유리 바이알을 씻는 시간과 노력을 절약 할 수 있습니다. 또한, 우라일 아세테이트 용액은 섹션염색(32)에반복적으로 사용될 수 있다. 단면을 염색한 후, 우라일 아세테이트 용액을 저장하고 재사용할 수 있습니다. 우라일 아세테이트는 방사성 물질이기 때문에, 그것의 재사용은 폐기물의 생성을 방지하고 환경 보호에 기여합니다.
플라즈마 중합 체압 나프탈렌 필름
플라즈마 중합 체포화 냅탈렌 필름은 광발방출(33)에서플라즈마 중합에 의해 냅탈렌 가스로 만든 3차원 중합탄소 필름이다. 이 필름은 전자 폭격 및 화학 물질에 대해 탄력적이며 전자에 대해 매우 깨끗하고 투명하며 평평한 표면과 비정질 구조를 가지고 있습니다. 따라서, 플라즈마 중합된 냅탈렌 필름은 시판되고, 우수하며, 지원 필름으로 권장된다.
The authors have nothing to disclose.
없음
Sandwich Freezing Device | Marine works Japan, Ltd, Yokosuka, Japan | MW-SFD-01 | with metal bar, thin metal bar, tweezers, and working bath |
10 mL glass vials | – | Scintillation counter vials for fixative | |
Acetone | – | ||
Osmium tetroxide | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3004 | 0.1 g |
Deep freezer | Sanyo Co. Ltd., Osaka | MDF-C8V1 | |
Copper disk | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
Slide glass | – | ||
Double-sided adhesive tape | – | ||
Single-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FAS-10 |
Double-edged razor blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Feather, FA-10 |
Shredded board | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 428 | |
Tweezers | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | – | Several pairs |
Tweezers with polystyrene foam | – | One pair | |
Glutaraldehyde | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 3052 | |
Liquid nitrogen | – | ||
Propane gas | – | Cryogen | |
Ion sputter apparatus | Hitachi high technologies, Tokyo | Hitachi E102 | |
Micropipette | – | For 1 mL, 200 μL, and 2 μL | |
Microcentrifuge | Tomy digital biology Co. Ltd., Tokyo | Capsulefuge, PMC-060 | |
Stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | – | SMZ 645 |
LED illumination for stereomicroscope | Nikon Co. Ltd., Tokyo et al. | SM-LW 61 Ji | |
Disposable plastic container | – | 50 mL and 200 mL | |
Ethane gas | – | Cryogen | |
2 mL Eppendorf tubes | – | For embedding | |
Disposable plastic syringes | – | 1 mL, 5 mL, 10 mL, and 20 mL | |
Magnetic stirrer | – | ||
Epoxy resin | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 340 | Quetol 812 set |
Silicon embedding mold | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 4217 | 7 mm in diameter, 13 mm deep |
Incubater | – | For 37 °C and 60 °C | |
Trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Tilting mechanism equipped, Refer to this paper |
LED illumination for trimming stage | Sunmag Co. Ltd., Tokyo | – | Refer to this paper |
Ultrasonic Trimming Blade | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 5240 | EM-240, Refer to this paper |
Ultramicrotome | Leica Microsystems, Vienna | Ultracut S | |
Grids | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2633, 2634 | 300 mesh, 400 mesh |
0.5% Neoprene W solution | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 605 | |
Perfect Loop | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 2351 | Fot retrieving sections |
Half Tube for section staining | Nisshin EM Co. Ltd., Tokyo | 463 | Refer to this pape |
Syringe filter | Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo | DISMIC-03CP | Cellulose acetate, 0.45 μm |
Transmission electron microscope | JEOL Co. Ltd., Tokyo | JEM-1400 |