Nous présentons ici un protocole pour étudier la compétitivité d’accouplement du mâle Aedes aegypti en utilisant un colorant fluorescent comme marqueur. Les moustiques femelles sont exposées à des mâles marqués et non marqués pour la copulation. Après l’accouplement, leurs spermathèques sont examinées au microscope à fluorescence pour déterminer leur partenaire d’accouplement.
Le succès des programmes de suppression des populations stériles ou incompatibles basés sur la technique des insectes dépend de la capacité des mâles relâchés à rivaliser pour les femelles de type sauvage et à induire la stérilité dans la population cible. Par conséquent, l’évaluation en laboratoire de la compétitivité de l’accouplement des mâles est essentielle pour évaluer l’aptitude de la souche de libération avant la libération sur le terrain. Classiquement, un tel test est effectué en déterminant la proportion d’œufs viables produits par les femelles après avoir été exposés simultanément à deux ensembles de mâles (souches de type sauvage et de libération) pour la copulation. Cependant, ce processus prend du temps et est laborieux en raison de la nécessité de nourrir d’abord les femelles par le sang pour la production d’œufs, puis d’éclore et de dénombrer les œufs éclos pour déterminer la viabilité des œufs.
De plus, cette méthode ne peut pas discerner le degré de compétitivité entre deux lignées de moustiques stériles ou infectées par Wolbachia,car les moustiques femelles de type sauvage ne produiront des œufs non viables qu’après l’accouplement avec les deux. Pour contourner ces limitations, cet article décrit une méthode plus directe de mesure de la compétitivité de l’accouplement des moustiques mâles en laboratoire en utilisant le colorant fluorescent, la rhodamine B (RhB), qui peut être utilisé pour marquer les mâles en les nourrissant dans une solution de saccharose contenant du RhB. Après le test d’accouplement, la présence de spermatozoïdes fluorescents dans les spermathèques d’une femelle peut être utilisée pour déterminer son partenaire d’accouplement. Cette méthode est rentable, réduit le temps expérimental de 90% et permet de comparer l’aptitude à l’accouplement entre deux lignées stériles ou infectées par Wolbachia.
L’élevage et la libération de mâles stériles ou incompatibles pour la suppression des populations de moustiques Aedes sont actuellement évalués sur le terrain en tant que nouvel outil pour prévenir les épidémies de dengue et d’autres maladies transmises par Aedes1. Les stratégies de suppression des rejets mâles qui font actuellement l’objet d’essais sur le terrain comprennent l’utilisation de la méthode génétique2,l’irradiation (technique de l’insecte stérile, SIT)3,la bactérie endosymbiotique Wolbachia (technique incompatible avec l’insecte, IIT)4, ou une combinaison des deux dernières techniques5,6. Le succès de ces approches dépend en grande partie de la capacité des mâles relâchés à surpasser les mâles de type sauvage et à rechercher des femelles pour assurer la copulation. Sinon, la stérilité ne peut pas être induite dans la population cible.
Dans un programme SIT classique, par exemple, l’aptitude à l’accouplement des mâles peut être affectée par des facteurs tels que la dosed’irradiation7,8,9, le protocole d’élevage de masse et l’étendue de la consanguinité dans la colonie10,11,12,13,14. En outre, des études sur la compétitivité de l’accouplement peuvent fournir des connaissances importantes sur le comportement d’accouplement des moustiques qui pourraient être utilisées pour éclairer les stratégies de lutte antivectorielle.
Dans sit sit et iit, la compétitivité d’accouplement des moustiques mâles est généralement évaluée en permettant à la fois aux souches de type sauvage et de relâchement de rivaliser pour les femelles de type sauvage dans une cage8,11,15,16. Les femelles sont ensuite nourries au sang et leurs œufs éclos pour déterminer la viabilité. Les femelles qui pondent des œufs non viables ou des œufs à faible taux d’éclosion sont supposées s’être accouplées avec des mâles de souche de libération, tandis que les femelles qui produisent des œufs viables sont supposées s’être accouplées avec des mâles de type sauvage. La compétitivité de l’accouplement est ensuite calculée avec l’indice de Fried17. Malheureusement, cette méthode est gourmande en ressources et prend beaucoup de temps, et l’indice de fried global peut être influencé par des facteurs de confusion externes affectant la viabilité des œufs, tels qu’une mauvaise manipulation des œufs et une dessiccation excessive, ce qui peut entraîner un faible taux d’éclosion dans le croisement de compatibilité, ce qui peut alors conduire à un indice de friture artificiellement bas.
De plus, cette méthode ne permet pas de comparer directement la compétitivité d’accouplement entre les moustiques Aedes qui sont infectés par différentes souches de Wolbachia ou qui sont exposés à différentes doses d’irradiation. Par conséquent, une méthode plus directe est nécessaire pour relever ces défis. Des études récentes18,19 ont démontré l’efficacité de l’utilisation du colorant fluorescent, RhB, pour marquer le liquide séminal des moustiques mâles. Le liquide séminal marqué est transféré et stocké dans les spermathèques des moustiques femelles lors d’un accouplement réussi, ce qui permet de mesurer directement l’interaction d’accouplement des femelles avec les mâles marqués. La rhodamine B est un colorant fluoré réactif au thiol couramment utilisé comme biomarqueur pour les études de recherche écologique et comportementale chez les animaux, y compris les insectes20. Pour les études sur les moustiques, le RhB est introduit en se nourrissant avec du sucre ou de l’eau de miel contenant de la poudre de RhB dissoute18,19,21 , 22,23,24. Lors de l’absorption, le colorant RhB se lie aux protéines, colorant les tissus du corps avec une tache rose rougeâtre qui fluorescent orange vif sous une source de lumière fluorescente.
Le fort signal de fluorescence et la stabilité du marquage, associés à sa capacité à tacher les liquides séminaux des insectes, permettent de surveiller le transfert du liquide séminal marqué du mâle marqué vers les organes de stockage du sperme de l’insecte femelle pour les étudesd’accouplement18,19,21,24. L’utilisation de RhB dans un test de compétitivité d’accouplement mâle permet non seulement de mesurer directement l’interaction d’accouplement des femelles avec des mâles marqués et non marqués, mais les résultats peuvent également être obtenus dans les 24 heures car ils évitent le processus de détermination de la viabilité des œufs, qui nécessite généralement environ 10 à 14 jours. De plus, cette méthode surmonte la perte potentielle de données lorsque les moustiques femelles ne se nourrissent pas de sang ou meurent avant la ponte. Ceci est particulièrement crucial car dans les essais semi-champs, où les moustiques femelles sont sujets aux dommages et à la mort lors de la collecte post-accouplement à l’aide d’un sac à dos ou d’un aspirateur mécanique. Pour répondre aux limites actuelles de l’utilisation de la fertilité féminine, nous présentons une méthode alternative qui utilise la coloration RhB pour mesurer directement la compétitivité de l’accouplement des moustiques mâles. La méthode simplifie le flux de travail, raccourcit le temps expérimental d’environ deux semaines à un jour, ce qui permet d’effectuer davantage de réplications expérimentales et permet de comparer deux souches de libération. Ce protocole conviendra aux laboratoires qui se lancent dans des programmes de suppression des populations de moustiques basés sur la libération de mâles et pourra être utilisé pour le contrôle de la qualité de routine et l’évaluation des souches.
Le marquage est couramment utilisé dans la recherche entomologique pour étudier la dynamique des populations d’insectes, la dispersion, le comportement et la biologie de l’accouplement26. Dans les programmes SIT et IIT, le marquage est effectué pour différencier la souche de libération de la population de terrain afin d’étudier leur dispersion et d’optimiser le rapport de libération. Les méthodes de marquage utilisées comprennent le marquage génétique27,28, l’incorporation d’isotopes dans les aliments larvaires29,30, la poussière fluorescente31et le colorant32. Pour la suppression des populations de moustiques à l’aide de SIT ou d’IIT, où la capacité d’accouplement des mâles est un composant essentiel, des colorants fluorescents ont été utilisés comme marqueurs pour étudier la biologie de l’accouplement des moustiques18,19.
Classiquement, l’évaluation de la compétitivité de l’accouplement mâle de la souche de libération a été évaluée à l’aide de tests de fertilité femelle. Cependant, ce test prend beaucoup de temps et de main-d’œuvre en raison des processus expérimentaux en aval post-accouplement(figure supplémentaire S1). Ces processus comprennent l’alimentation sanguine des femelles, la collecte des œufs, l’éclosion des œufs et le dénombrement de la proportion d’œufs éclos pour déterminer la viabilité des œufs. En moyenne, ce test nécessite 30 heures de travail et deux semaines de travail expérimental (à partir de la mise en place des cages d’essai de compétitivité) jusqu’à la détermination finale de la compétitivité de l’accouplement des mâles.
son article présente l’utilisation d’un colorant fluorescent, rhB, (nourri sous forme de 0,2 % de RhB-saccharose aux moustiques, figure supplémentaire S2)pour mesurer directement les interactions d’accouplement entre les femelles et les mâles marqués RhB. Bien que ce protocole nécessite un stéréomicroscope à fluorescence, il évite d’avoir à effectuer les procédures expérimentales fastidieuses mentionnées ci-dessus. En moyenne, ce test basé sur rhB nécessite environ 10 heures de travail et environ une journée pour obtenir des données équivalentes à ceux des tests de fertilité féminine. Ce gain de temps >90% permet aux chercheurs d’effectuer plusieurs répétitions expérimentales, offrant une validation plus robuste de la capacité d’accouplement des mâles. En outre, ce test peut être utilisé pour comparer la compétitivité d’accouplement entre deux lignées de moustiques stériles ou infectées par Wolbachia.
Ce type de comparaison n’est pas possible avec les tests de fertilité femelles conventionnels, car les femelles produiraient des œufs non viables lors de l’accouplement avec ces deux lignées. Néanmoins, tout accouplement mixte dans l’expérience entraînera un biais en faveur de la population marquée, car il est difficile d’identifier les spermatozoïdes non marqués chez les spermathèques femelles qui contiennent du liquide séminal provenant de mâles marqués et non marqués. Une conclusion similaire a été faite dans une étude évaluant la compétitivité d’accouplement d’Anopheles gambiae en utilisant RhB18, dans laquelle une plus grande proportion de femelles dans le test d’accouplement s’est avérée être accouplée par des mâles marqués. Comme la polyandrie est plus susceptible de se produire chez les femelles qui s’étaient précédemment engagées dans un accouplement interrompu33, la probabilité que cela se produise a été réduite dans cette étude en utilisant moins de moustiques (20 mâles à 10 femelles) dans un plus grand volume de cage (0,216 m3)dans ces expériences.
Les résultats n’ont montré aucun biais en faveur de la population marquée RhB, ce qui indique que l’accouplement mixte était limité. En résumé, l’incorporation de RhB pour marquer les mâles dans un test de compétitivité d’accouplement est un moyen économique et rapide d’évaluer l’aptitude à l’accouplement des mâles. Cette méthode permet également de comparer directement la compétitivité de l’accouplement entre les mâles exposés à différentes doses d’irradiation, élevés dans différents régimes d’élevage, ou ceux infectés par différentes souches de Wolbachia,ce qui en fait un outil précieux pour l’évaluation de l’aptitude à l’accouplement des mâles pour tout programme de suppression de la population de moustiques basé sur la libération des mâles.
The authors have nothing to disclose.
Cette étude a été financée par la National Environment Agency (NEA) de Singapour. Nous remercions M. Chew Ming Fai, directeur général adjoint (santé publique), NEA, pour son approbation de publier l’étude, et A/Prof Ng Lee Ching, directeur de groupe (Environmental Health Institute Group), NEA, pour son soutien dans cette étude. Nous remercions également le Dr Shuzhen Sim et le Dr Denise Tan d’avoir relu le manuscrit.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
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Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |