Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Untersuchung der Paarungswettbewerbsfähigkeit von männlichen Aedes aegypti unter Verwendung von Fluoreszenzfarbstoff als Marker. Weibliche Moskitos sind sowohl markierten als auch unmarkierten Männchen zur Kopulation ausgesetzt. Nach der Paarung werden ihre Spermatheken unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, um ihren Paarungspartner zu bestimmen.
Der Erfolg steriler oder inkompatibler insektentechnischer Populationsunterdrückungsprogramme hängt von der Fähigkeit der freigelassenen Männchen ab, um Wildtyp-Weibchen zu konkurrieren und Sterilität in der Zielpopulation zu induzieren. Daher ist die Laborbewertung der männlichen Paarungswettbewerbsfähigkeit unerlässlich, um die Fitness der Freisetzungssorte vor der Freisetzung zu bewerten. Herkömmlicherweise wird ein solcher Assay durchgeführt, indem der Anteil der lebensfähigen Eier bestimmt wird, die von den Weibchen produziert werden, nachdem sie gleichzeitig zwei Gruppen von Männchen (Wildtyp- und Freisetzungsstämme) zur Kopulation ausgesetzt wurden. Dieser Prozess ist jedoch zeitaufwendig und mühsam, da die Weibchen zuerst für die Eierproduktion mit Blut gefüttert und dann die geschlüpften Eier ausgeheckt und aufgezählt werden müssen, um die Lebensfähigkeit der Eier zu bestimmen.
Darüber hinaus kann diese Methode den Grad der Wettbewerbsfähigkeit zwischen zwei sterilen oder Wolbachia-infiziertenMückenlinien nicht erkennen, da wildartige weibliche Moskitos nur bei der Paarung mit beiden nicht lebensfähige Eier produzieren. Um diese Einschränkungen zu umgehen, beschreibt dieses Papier eine direktere Methode zur Messung der Paarungsfähigkeit männlicher Mücken in Laborumgebungen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Rhodamin B (RhB), mit dem Männchen markiert werden können, indem sie in RhB-haltiger Saccharoselösung gefüttert werden. Nach dem Paarungstest kann das Vorhandensein von fluoreszierenden Spermien in den Spermatheken eines Weibchens verwendet werden, um ihren Paarungspartner zu bestimmen. Diese Methode ist kostengünstig, reduziert die Versuchszeit um 90% und ermöglicht den Vergleich der Paarungstauglichkeit zwischen zwei sterilen oder Wolbachia-infiziertenLinien.
Die Aufzucht und Freisetzung steriler oder inkompatibler Männchen zur Unterdrückung von Aedes-Mückenpopulationen wird derzeit im Feld als neuartiges Instrument zur Verhinderung von Dengue-Ausbrüchen und anderen durch Aedes übertragenenKrankheiten evaluiert1. Männliche Freisetzungsunterdrückungsstrategien, die sich derzeit in Feldversuchen befinden, umfassen die Verwendung der genetischen Methode2, Bestrahlung (Sterile Insect Technique, SIT)3, endosymbiotische Bakterien Wolbachia (Insect Incompatible Technique, IIT) 4 oder eine Kombination derbeidenletzteren Techniken5,6. Der Erfolg dieser Ansätze hängt weitgehend von der Fähigkeit der freigelassenen Männchen ab, Wildtyp-Männchen zu übertreffen und Weibchen zu suchen, um die Kopulation zu sichern. Andernfalls kann die Sterilität in der Zielpopulation nicht induziert werden.
In einem klassischen SIT-Programm kann beispielsweise die männliche Paarungstauglichkeit durch Faktoren wie Bestrahlungsdosis7,8,9, Massenaufzuchtprotokoll und das Ausmaß der Inzucht in der Kolonie10 , 11,12,13,14beeinflusst werden. Darüber hinaus können Studien zur Paarungswettbewerbsfähigkeit wichtige Erkenntnisse über das Paarungsverhalten von Mücken liefern, die zur Information über Vektorkontrollstrategien verwendet werden könnten.
In SIT und IIT wird die Paarungswettbewerbsfähigkeit männlicher Moskitos typischerweise bewertet, indem sowohl Wildtyp-als auch Freisetzungsstämme ineinem Käfig 8, 11 ,15,16um Wildtypweibweibinnen konkurrieren können . Weibchen werden dann mit Blut gefüttert und ihre Eier geschlüpft, um die Lebensfähigkeit zu bestimmen. Es wird angenommen, dass Weibchen, die nicht lebensfähige Eier oder Eier mit niedriger Schlupfrate legen, sich mit Männchen des Freisetzungsstamms gepaart haben, während Weibchen, die lebensfähige Eier produzieren, sich vermutlich mit Wildtyp-Männchen gepaart haben. Die Paarungswettbewerbsfähigkeit wird dann mit dem Fried Index17berechnet. Leider ist diese Methode ressourcenintensiv und zeitaufwendig, und der gesamte Fried Index kann durch externe Störfaktoren beeinflusst werden, die die Lebensfähigkeit der Eier beeinflussen, wie schlechtes Eierhandling und Übermäßigetrocknung, die zu einer niedrigen Schlupfrate im Kompatibilitätskreuz führen kann, die dann zu einem künstlich niedrigen Fried Index führen kann.
Darüber hinaus erlaubt diese Methode keinen direkten Vergleich der Paarungswettbewerbsfähigkeit zwischen Aedes-Moskitos, die mit verschiedenen Wolbachia-Stämmen infiziert sind oder unterschiedlichen Bestrahlungsdosen ausgesetzt sind. Daher ist eine direktere Methode erforderlich, um diese Herausforderungen anzugehen. Jüngste Studien18,19 haben die Wirksamkeit der Verwendung des fluoreszierenden Farbstoffs RhB zur Markierung der Samenflüssigkeit männlicher Moskitos gezeigt. Markierte Samenflüssigkeit wird übertragen und nach erfolgreicher Paarung in den Spermatheken der weiblichen Moskitos gespeichert, was eine direkte Messung der weiblichen Paarungsinteraktion mit markierten Männchen ermöglicht. Rhodamin B ist ein Thiol-reaktiver Fluoronfarbstoff, der häufig als Biomarker für ökologische und verhaltenswissenschaftliche Studien an Tieren einschließlich Insekten verwendet wird20. Für Mückenstudien wird RhB durch Fütterung mit Zucker oder Honigwasser eingebracht, das gelöstes RhB-Pulver18,19,21,22,23,24 enthält. Bei der Aufnahme bindet der RhB-Farbstoff an Proteine und färbt das Körpergewebe mit einem rötlich-rosa Fleck, der unter einer fluoreszierenden Lichtquelle leuchtend orange fluoresziert.
Das starke Fluoreszenzsignal und die Stabilität der Markierung, gepaart mit ihrer Fähigkeit, Insekten-Samenflüssigkeiten zu färben, ermöglicht die Überwachung der Übertragung von markierter Samenflüssigkeit vom markierten Männchen zu den Spermienspeicherorganen des weiblichen Insekts für Paarungsstudien18,19,21,24. Die Verwendung von RhB in einem männlichen Paarungs-Wettbewerbstest ermöglicht nicht nur die direkte Messung der Paarungsinteraktion von Weibchen mit markierten und unmarkierten Männchen, sondern die Ergebnisse können auch innerhalb von 24 Stunden erzielt werden, da sie den Prozess der Bestimmung der Eilebensfähigkeit, der typischerweise etwa 10 bis 14 Tage dauert, entfällt. Darüber hinaus überwindet diese Methode den potenziellen Datenverlust, wenn die weiblichen Moskitos vor der Eiablage nicht bluten oder sterben. Dies ist besonders wichtig, da weibliche Moskitos bei Halbfeldversuchen anfällig für Schäden und Tod während der Nachpaarungssammlung mit einem Rucksack oder einem mechanischen Absauger sind. Um die derzeitigen Einschränkungen der Verwendung der weiblichen Fruchtbarkeit zu beheben, stellen wir eine alternative Methode vor, die RhB-Färbung verwendet, um die Paarungswettbewerbsfähigkeit männlicher Mücken direkt zu messen. Die Methode vereinfacht den Workflow, verkürzt die Experimentellenzeit von etwa zwei Wochen auf einen Tag, so dass mehr experimentelle Replikate durchgeführt werden können und ermöglicht den Vergleich zwischen zwei Freisetzungsstämmen. Dieses Protokoll eignet sich für Labore, die programme zur Unterdrückung der Mückenpopulation durch männliche Freisetzungen durchführen, und kann für die routinemäßige Qualitätskontrolle und Stammbewertung verwendet werden.
Markierung wird häufig in der entomologischen Forschung verwendet, um die Dynamik, Ausbreitung, das Verhalten und die Paarungsbiologie von Insektenpopulationen zu untersuchen26. In SIT- und IIT-Programmen wird die Markierung durchgeführt, um den Freisetzungsstamm von der Feldpopulation zu unterscheiden, ihre Ausbreitung zu untersuchen und das Freisetzungsverhältnis zu optimieren. Die verwendeten Markierungsmethoden umfassen die genetische Markierung27,28, die Isotope in Larvenfutter29,30, fluoreszierendem Staub31und Farbstoff32. Zur Unterdrückung von Mückenpopulationen mit SIT oder IIT, bei denen die männliche Paarungsfitness eine kritische Komponente ist, wurden fluoreszierende Farbstoffe als Marker verwendet, um die Paarungsbiologie von Moskitos zu untersuchen18,19.
Herkömmlicherweise wurde die Beurteilung der männlichen Paarungswettbewerbsfähigkeit des Freisetzungsstamms mit weiblichen Fruchtbarkeitstests bewertet. Dieser Assay ist jedoch aufgrund nachgelagerter experimenteller Prozesse nach der Paarung zeit- und arbeitsintensiv (Ergänzende Abbildung S1). Diese Prozesse umfassen die Blutfütterung der Weibchen, die Eizellentnahme, das Schlüpfen der Eier und die Aufzählung des Anteils der geschlüpften Eier, um die Lebensfähigkeit der Eier zu bestimmen. Im Durchschnitt erfordert dieser Assay 30 Arbeitsstunden und zwei Wochen experimentelle Arbeit (beginnend mit der Einrichtung der Wettbewerbs-Assay-Käfige) bis zur endgültigen Bestimmung der männlichen Paarungswettbewerbsfähigkeit.
seine Arbeit stellt die Verwendung eines fluoreszierenden Farbstoffs, RhB, (gefüttert als 0,2% RhB-Saccharose an die Moskitos, Ergänzende Abbildung S2)zur direkten Messung von Paarungsinteraktionen zwischen Weibchen und RhB-markierten Männchen vor. Während dieses Protokoll ein Fluoreszenz-Stereomikroskop erfordert, entfällt die Notwendigkeit, die oben genannten zeitaufwändigen experimentellen Verfahren durchzuführen. Im Durchschnitt benötigt dieser RhB-basierte Assay etwa 10 Mannstunden und etwa einen Tag, um Daten zu erhalten, die denen von weiblichen Fruchtbarkeitstests entsprechen. Dies Diese >90% Zeitersparnis ermöglicht es Forschern, mehrere experimentelle Replikate durchzuführen, was eine robustere Validierung der männlichen Paarungsfitness ermöglicht. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um die Paarungswettbewerbsfähigkeit zwischen zwei sterilen oder Wolbachia-infizierten Moskitoslinien zu vergleichen.
Diese Art des Vergleichs ist mit herkömmlichen weiblichen Fruchtbarkeitstests nicht möglich, da Weibchen bei der Paarung mit beiden solchen Linien nicht lebensfähige Eier liefern würden. Ungeachtet dessen wird jede gemischte Paarung im Experiment zu einer Verzerrung gegenüber der markierten Population führen, da es schwierig ist, unmarkierte Spermien in weiblichen Spermatheken zu identifizieren, die Samenflüssigkeit sowohl von RhB-markierten als auch von unmarkierten Männchen enthalten. Eine ähnliche Schlussfolgerung wurde in einer Studie zur Bewertung der Paarungswettbewerbsfähigkeit von Anopheles gambiae mit RhB18gezogen, wobei ein größerer Anteil von Weibchen im Paarungstest von markierten Männchen gepaart wurde. Da Polyandrie bei Weibchen, die zuvor eine unterbrochene Paarung33hatten, häufiger auftritt, wurde die Wahrscheinlichkeit, dass dies auftritt, in dieser Studie reduziert, indem in diesen Experimenten weniger Moskitos (20 Männchen bis 10 Weibchen) in einem größeren Käfigvolumen (0,216m3)verwendet wurden.
Die Ergebnisse zeigten keine Verzerrung gegenüber der RhB-markierten Population, was darauf hindeutet, dass die gemischte Paarung begrenzt war. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Einbeziehung der RhB zur Kennzeichnung von Männchen in einen Paarungswettbewerbsfähigkeitstest eine wirtschaftliche und schnelle Möglichkeit zur Bewertung der männlichen Paarungstauglichkeit ist. Diese Methode ermöglicht auch den direkten Vergleich der Paarungswettbewerbsfähigkeit zwischen Männchen, die unterschiedlichen Bestrahlungsdosen ausgesetzt sind, in verschiedenen Aufzuchtregimen aufgezogen werden, oder solchen, die mit verschiedenen Wolbachia-Stämmeninfiziert sind, was sie zu einem wertvollen Werkzeug für die Bewertung der männlichen Paarungstauglichkeit für jedes männliche Freisetzungs-basierte Mückenpopulationsunterdrückungsprogramm macht.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie wurde von der National Environment Agency (NEA), Singapur, finanziert. Wir danken Herrn Chew Ming Fai, Deputy Chief Executive Officer (Public Health), NEA, für seine Genehmigung zur Veröffentlichung der Studie und A/Prof. Ng Lee Ching, Group Director (Environmental Health Institute Group), NEA, für ihre Unterstützung bei dieser Studie. Wir danken auch Dr. Shuzhen Sim und Dr. Denise Tan für das Korrekturlesen des Manuskripts.
Compound light microscope | Olympus | CX23 | To score for spermathecae insemination |
Dissection forceps | Bioquip | Rubis forceps (4524) | |
Fluorescence stereo-light microscope with RFP1 filter | Olympus | SZX16 | To check for Rhodamine B fluorescence signal |
Mosquito cages | Bugdorm | 4F3030 | W 32.5 cm x D 32.5 cm x H 32.5 cm; mesh size of 150 x 150; 160 µm aperture For holding of male and female adult mosquitoes prior to mating assay |
6M610 | W 60 cm x D 60 cm x H 60 cm; mesh size of 44 x 32; 650 µm aperture For mating competitiveness assay |
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Mosquito netting | 150 x 150, 160 µm aperture | ||
Rhodamine B | Sigma Aldrich | R6626 | ≥95% (HPLC) |
Stereo-light microscope | Olympus | SZ61 | For spermathecae dissection |
Sucrose | MP Biomedicals | SKU 029047138 | Food grade |
TetraMin tropical flakes | Tetra | 77101 | Fish food for feeding larvae |