Her beskriver vi et optimalisert retinal organoid induksjonssystem, som er egnet for ulike menneskelige pluripotente stamcellelinjer for å generere netthinnevev med høy reproduserbarhet og effektivitet.
Retinal degenerative sykdommer er hovedårsakene til irreversibel blindhet uten effektiv behandling. Pluripotente stamceller som har potensial til å skille seg ut i alle typer netthinneceller, til og med mini-retinal vev, holder store løfter for pasienter med disse sykdommene og mange muligheter innen sykdomsmodellering og legemiddelscreening. Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er imidlertid komplisert og tidkrevende. Her beskriver vi en optimalisert retinal induksjonsprotokoll for å generere retinal vev med høy reproduserbarhet og effektivitet, egnet for ulike menneskelige pluripotente stamceller. Denne protokollen utføres uten tilsetning av retinoinsyre, noe som fordeler berikelsen av kegle fotoreseptorer. Fordelen med denne protokollen er kvantifisering av EB-størrelse og platingtetthet for å forbedre effektiviteten og repeterbarheten av retinal induksjon betydelig. Med denne metoden vises alle store retinale celler sekvensielt og rekapitulerer hovedtrinnene i retinal utvikling. Det vil lette nedstrømsapplikasjoner, for eksempel sykdomsmodellering og celleterapi.
Retinal degenerative sykdommer (RDs), som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og retinitis pigmentosa (RP), er preget av dysfunksjon og død av fotoreseptorceller og fører vanligvis til irreversibel synstap uten effektive måter å kurere1. Mekanismen som ligger til grunn for disse sykdommene er i stor grad ukjent delvis på grunn av mangel på menneskelige sykdomsmodeller2. I løpet av de siste tiårene har det blitt oppnådd betydelige fremskritt innen regenerativ medisin gjennom stamcelleteknologi. Mange forskere, inkludert oss selv, har vist at humane pluripotente stamceller (hPSCer), inkludert humane embryonale stamceller (hESCer) og menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer), kan skille seg ut i alle typer netthinneceller, til og med mini-netthinnevev gjennom ulike differensieringsmetoder3,4,5,6,7,8,9,10, 11, gir stort potensial i sykdomsmodellering og celleterapi12,13,14.
Induksjonsprosessen fra hPSCer til netthinneceller er imidlertid svært komplisert og tidkrevende med lav repeterbarhet, noe som krever forskere med rik erfaring og høye ferdigheter. Under den komplekse og dynamiske induksjonsprosessen vil en rekke faktorer påvirke utbyttet av netthinnevev15,16,17. Også ulike induksjonsmetoder varierer ofte betydelig i timing og robust uttrykk for netthinnemarkører, noe som kan forvirre utvalgsinnsamlingen og datatolkningen3. Derfor vil en enkel protokoll for retinal differensiering fra hPSCer med trinnvis veiledning være etterspurt.
Her, basert på våre publiserte studier18,19,20,21, beskrives en optimalisert retinal induksjonsprotokoll for å generere retinal organoider (ROer) med rike kjeglefotoreseptorer fra hPSCer, noe som ikke krever tilskudd av retinoinsyre (RA). Denne protokollen fokuserer på beskrivelsen av flertrinnsmetoden for å generere nevral netthinne og RPE. EB-dannelse er den essensielle delen av det tidlige induksjonsstadiet. Både størrelse og plating tetthet av EBs er kvantitativt optimalisert, noe som vitenskapelig forbedrer utbyttet av retinal vev og fremmer repeterbarhet. I den andre delen av induksjonen organiserer optiske vesikler (OVs) seg selv i overholdelseskulturen og ROene i suspensjonskulturen; Tidskursene og effektiviteten til denne delen varierer betydelig i forskjellige hPSC-linjer. Modning og spesifikasjon av retinalceller i ROer forekommer hovedsakelig i midten og sen fase av induksjon. Uten tilsetning av RA kan modne fotoreseptorer med både rike kjegler og stenger produseres.
Formålet med denne protokollen er å kvantitativt beskrive og detaljere hvert trinn for uerfarne forskere å gjenta. Ulike hPSC linjer har blitt vellykket indusert i ROs av denne protokollen med et robust utbytte av kjeglerik retinal vev og høy repeterbarhet. HPSCs-avledede ROer med denne protokollen kan rekapitulere hovedtrinnene for retinal utvikling i vivo, og overleve langsiktige, noe som letter nedstrøms applikasjoner, for eksempel sykdomsmodellering, legemiddelscreening og celleterapi.
I denne flertrinns retinal induksjonsprotokollen ble hPSC-er veiledet trinn for trinn for å få retinal skjebne, og selvorganisert i retinal organoider som inneholder laminert NR og RPE. Under differensiering, hPSC recapitulated alle viktige trinn i menneskelig retinal utvikling i vivo, fra EF, OV, og RPE, til retinal laminering, generere alle undertyper av retinal celler, inkludert retinal ganglion celler, amacrine celler, bipolare celler, stang, og kjegle fotoreseptorer, og muller glial celler i en romlig og …
The authors have nothing to disclose.
Denne studien ble støttet av National Key R&D Program of China (2016YFC1101103, 2017YFA0104101), Guangzhou Science and Technology Project Fund (201803010078), Science &technology Project of Guangdong Province (2017B020230003), Natural Science Foundation (NSF) i Kina (81570874, 81970842), Hundred talent program of Sun Yat-sen University (PT1001010), og fundamentale forskningsmidler av State Key Laboratory of Ophthalmology.
(−)-Blebbistatin | Sigma | B0560-5mg | ROCK-inhibitor |
1 ml tips | Kirgen | KG1313 | 1 ml |
10 ml pipette | Sorfa | 3141001 | Pipette |
100 mm Tissue culture | BIOFIL | TCD000100 | 100 mm Petri dish |
100 mm Tissue culture | Falcon | 353003 | 100 mm Petri dish |
15 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011150 | Centrifuge tubes |
35 mm Tissue culture dishes | Falcon | 353001 | 35 mm Petri dish |
5 ml pipette | Sorfa | 313000 | Pipette |
50 ml Centrifuge tubes | BIOFIL | CFT011500 | Centrifuge tubes |
6 wells tissue culture plates | Costar | 3516 | Culture plates |
Anti-AP2α Antibody | DSHB | 3b5 | Primary antibody |
ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X | Gibco | 15240062 | Antibiotic-Antimycotic |
Anti-ISL1 Antibody | Boster | BM4446 | Primary antibody |
Anti-Ki67 Antibody | Abcam | ab15580 | Primary antibody |
Anti-L/M opsin Antibody | gift from Dr. jeremy | / | Primary antibody |
Anti-PAX6 Antibody | DSHB | pax6 | Primary antibody |
Anti-rabbit 555 | Invitrogen | A31572 | Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
Anti-Recoverin Antibody | Millipore | ab5585 | Primary antibody |
Anti-Rhodopsin Antibody | Abcam | ab5417 | Primary antibody |
Anti-sheep 555 | Invitrogen | A21436 | Donkey anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 |
Anti-SOX9 Antibody | Abclonal | A19710 | Primary antibody |
Anti-VSX2 Antibody | Millipore | ab9016 | Primary antibody |
B-27 supplement W/O VIT A (50X) | Gibco | 12587010 | Supplement |
Cryotube vial | Thermo scientific-NUNC | 375418 | 1.8 ml |
DAPI | DOJINDO | D532 | 4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
Dimethyl sulphoxide(DMSO) Hybri-max | Sigma | D2650-100ML | Multiple suppliers |
DMEM | Gibco | C11995500BT | Medium |
DMEM /F12 | Gibco | C11330500BT | Medium |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 | 0.5 M PH 8.0 |
FBS | NATOCOR | SFBE | Serum |
Filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22μm, sterile Millex filter |
GlutaMax, 100X | Gibco | 35050061 | L-alanyl-L-glutamine |
Heparin | Sigma | H3149 | 2 mg/ml in PBS to use |
Matrigel, 100x | Corning | 354277 | Extracellular matrix (ECM) |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | MEM NEAA |
mTeSR1 | STEM CELL | 85850 | hPSCs maintenance medium (MM) |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | Supplement |
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer | GNM | GNM10010 | Without Ca+,Mg+,PH7.2±0.1 0.1M |
Taurine | Sigma | T0625 | Supplement |
Ultra-low attachment culture dishes 100mm petri dish, low-attachment | Corning | CLS3262-20EA | Petri dish |