Produktion von monoklonalen Antikörpern gegen Aminopeptidase N im Darmschleimhautepithel des Schweins
Summary
Das rekombinante Antikörperprotein, das in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen und monoklonalen Antikörpern, die mit der traditionellen Hybridomtechnologie hergestellt werden, exprimiert wird, kann das porcine Aminopeptidase N (APN)-Protein erkennen und daran binden.
Abstract
Porcine Aminopeptidase N (APN), eine membrangebundene Metallopeptidase, die reichlich in der Dünndarmschleimhaut vorkommt, kann eine mukosale Immunantwort auslösen, ohne dass es zu Störungen wie geringer Proteinexpression, Enzyminaktivität oder strukturellen Veränderungen kommt. Dies macht APN zu einem attraktiven Kandidaten für die Entwicklung von Impfstoffen, die selektiv auf das Schleimhautepithel abzielen. Frühere Studien haben gezeigt, dass APN ein Rezeptorprotein sowohl für enterotoxigene Escherichia coli (E. coli) F4 als auch für das übertragbare Gastroenteritisvirus ist. Daher ist APN vielversprechend bei der Entwicklung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten oder neuartigen Impfstoffen auf Basis von APN-spezifischen Antikörpern. In dieser Studie verglichen wir die Produktion von APN-spezifischen monoklonalen Antikörpern (mAbs) unter Verwendung der traditionellen Hybridomtechnologie und der rekombinanten Antikörperexpressionsmethode. Wir etablierten auch eine stabil transfizierte Ovarialzelllinie des Chinesischen Hamsters (CHO) unter Verwendung von pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN und einem E. coli-Expressionsstamm BL21(DE3), der den pET28a (+)-rAbs-APN-Vektor beherbergt . Die Ergebnisse zeigen, dass Antikörper, die in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen exprimiert werden, und mAbs, die mit Hilfe von Hybridomen hergestellt werden, das APN-Protein erkennen und daran binden können. Dies bildet die Grundlage für die weitere Aufklärung der Funktion des APN-Rezeptors für die Entwicklung von Therapeutika, die auf verschiedene APN-spezifische Epitope abzielen.
Introduction
Aminopeptidase N (APN), ein Schwarzlichtenzym, das zur Familie der Metalloproteinase M1 gehört, fungiert über enzymabhängige und enzymunabhängige Signalwege als Tumormarker, Rezeptor und Signalmolekül 1,2. Neben der Spaltung der N-terminalen Aminosäurereste verschiedener bioaktiver Peptide zur Regulation ihrer biologischen Aktivität spielt APN eine wichtige Rolle bei der Pathogenese verschiedener entzündlicher Erkrankungen. APN ist an der Antigenprozessierung und -präsentation durch getrimmte Peptide beteiligt, die fest an wichtige Histokompatibilitätskomplexe der Klasse II binden 2,3. APN übt auch entzündungshemmende Wirkungen aus, indem es an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bindet, die an der multiplen Signaltransduktion beteiligt sind, die Zytokinsekretion moduliert und zur Fc-Gammarezeptor-vermittelten Phagozytose in der Immunantwort beiträgt 4,5,6,7.
Als weit verbreitete membrangebundene Exopeptidase ist APN in der Dünndarmschleimhaut des Schweins reichlich vorhanden und steht in engem Zusammenhang mit der rezeptorvermittelten Endozytose 1,5,8. APN erkennt und bindet das Spike-Protein des transmissiblen Gastroenteritis-Virus für den Zelleintritt und interagiert direkt mit der FaeG-Untereinheit der enterotoxigenen Escherichia coli F4-Fimbrien, um die bakterielle Adhärenz mit Wirtszellen zu beeinflussen 9,10,11. Damit ist APN ein potenzielles therapeutisches Ziel bei der Behandlung viraler und bakterieller Infektionskrankheiten.
Seit der Entwicklung der Hybridomtechnologie und anderer Strategien für die Produktion monoklonaler Antikörper (mAbs) im Jahr 1975 werden mAbs in großem Umfang in der Immuntherapie, der Verabreichung von Medikamenten und der Diagnose eingesetzt12,13,14. Derzeit werden mAbs erfolgreich zur Behandlung von Krankheiten wie Krebs, entzündlichen Darmerkrankungen und Multipler Sklerose eingesetzt12,15. Aufgrund ihrer starken Affinität und Spezifität können mAbs ideale Ziele bei der Entwicklung von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADC) oder neuen Impfstoffen sein16,17. Das APN-Protein ist entscheidend für die selektive Abgabe von Antigenen an bestimmte Zellen und kann eine spezifische und starke mukosale Immunantwort gegen Krankheitserreger hervorrufen, ohne dass es zu Störungen kommt, einschließlich geringer Proteinexpression, Enzyminaktivität oder struktureller Veränderungen 5,8,18. Daher sind Therapeutika, die auf APN-spezifischen mAbs basieren, vielversprechend gegen bakterielle und virale Infektionen. In dieser Arbeit beschreiben wir die Produktion von APN-spezifischen mAbs mit Hilfe der Hybridomtechnologie und die Expression von anti-APN rekombinanten Antikörpern (rAbs) mit Hilfe von prokaryotischen und eukaryotischen Vektoren. Das Ergebnis deutet darauf hin, dass das APN-Protein sowohl von rAbs, die in pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO-Zellen exprimiert werden, als auch von Hybridom-abgeleiteten mAbs erkannt wurde.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Induktion der Schleimhautimmunität ist einer der effektivsten Ansätze zur Bekämpfung von Krankheitserregern und zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Krankheiten. APN, ein hochexprimiertes membrangebundenes Protein in der Darmschleimhaut, ist an der Induktion der adaptiven Immunantwort und an der rezeptorvermittelten viralen und bakteriellen Endozytose beteiligt 1,5,8. APN wird als Antigenpartikel in vielen Formaten…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch das Stipendium der Chinese National Science Foundation (Nr. 32072820, 31702242), Zuschüsse aus dem Jiangsu Government Scholarship for Overseas Studies (JS20190246) und High-Level Talents of Yangzhou University Scientific Research Foundation unterstützt, ein Projekt, das vom Priority Academic Program of Development der Jiangsu High Education Institution gegründet wurde.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
References
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