Isolering av humane primære ventilceller for in vitro sykdomsmodellering
Summary
Denne protokollen beskriver samlingen av humane aortaklaffer ekstrahert under kirurgiske aortaklaffutskiftningsprosedyrer eller fra kadaverisk vev, og den påfølgende isolasjonen, utvidelsen og karakteriseringen av pasientspesifikke primære ventilendotel- og interstitielle celler. Inkludert er viktige detaljer om prosessene som trengs for å sikre cellens levedyktighet og fenotypespesifisitet.
Abstract
Kalsial aortaklaffsykdom (CAVD) er tilstede i nesten en tredjedel av den eldre befolkningen. Fortykkelse, avstivning og forkalkning av aortaklaffen forårsaker aortastenose og bidrar til hjertesvikt og hjerneslag. Sykdomspatogenese er multifaktoriell, og spenninger som betennelse, ekstracellulær matriseombygging, turbulent strømning og mekanisk stress og belastning bidrar til osteogen differensiering av ventilendotel- og ventilinterstitielle celler. Imidlertid er de nøyaktige initierende faktorene som driver den osteogene overgangen til en sunn celle til en forkalkningscelle, ikke fullt definert. Videre er den eneste aktuelle behandlingen for CAVD-indusert aortastenose aortaklaffutskifting, hvorved den opprinnelige ventilen fjernes (kirurgisk aortaklaffutskifting, SAVR) eller en fullt sammenleggbar erstatningsventil settes inn via et kateter (transkateter aortaklaffutskifting, TAVR). Disse kirurgiske prosedyrene kommer til en høy pris og med alvorlige risikoer; Dermed er det viktig å identifisere nye terapeutiske mål for narkotikaforskning. For dette formål utvikler denne studien en arbeidsflyt der kirurgisk fjernet vev fra pasienter og donorkadavervev brukes til å lage pasientspesifikke primære linjer med valvulære celler for in vitro sykdomsmodellering. Denne protokollen introduserer bruken av en kald lagringsløsning, som ofte brukes i organtransplantasjon, for å redusere skaden forårsaket av den ofte lange anskaffelsestiden mellom vevseksisjon og laboratoriebehandling med fordelen av sterkt stabiliserende celler i det utskårne vevet. Resultatene fra denne studien viser at isolerte ventilceller beholder sin proliferative kapasitet og endotel- og interstitielle fenotyper i kultur opptil flere dager etter ventilfjerning fra donoren. Bruk av disse materialene tillater innsamling av kontroll- og CAVD-celler, hvorfra både kontroll- og sykdomscellelinjer etableres.
Introduction
Calcific aortaklaffsykdom (CAVD) er en kronisk patologi preget av betennelse, fibrose og makrokalsifisering av aortaklaffbrosjyrer. Progressiv ombygging og forkalkning av brosjyrene (kalt aortasklerose) kan føre til obstruksjon av blodstrømmen (aortastenose) som bidrar til hjerneslag og fører til hjertesvikt. For tiden er den eneste behandlingen for CAVD kirurgisk eller transkateter aortaklaffutskifting (henholdsvis SAVR og TAVR). Det er ikke noe ikke-kirurgisk alternativ for å stoppe eller reversere CAVD-progresjon, og uten ventilutskifting nærmer dødeligheten seg 50% innen 2-3 år 1,2,3. Definere de underliggende mekanismene som driver denne patologien vil identifisere potensielle nye terapeutiske tilnærminger.
I en sunn voksen er aortaklaffbladene omtrent en millimeter tykke, og deres hovedfunksjon er å opprettholde den ensrettede strømmen av blod ut av venstre ventrikel4. Hver av de tre brosjyrene består av et lag av ventilendotelceller (VEC) som strekker den ytre overflaten av pakningsvedlegget og fungerer som en barriere. VEC opprettholder ventilhomeostase ved å regulere permeabilitet, inflammatorisk celleadhesjon og parakrin signalering 5,6,7. Ventilinterstitielle celler (VIC) utgjør de fleste cellene i ventilpakningsvedlegget8. VIC er arrangert i tre karakteristiske lag i pakningsvedlegget. Disse lagene er kjent som ventricularis, spongiosa og fibrosa9. Ventrikkelis vender mot venstre ventrikel og inneholder kollagen og elastinfibre. Det midterste laget, spongiosa, inneholder høyt proteoglykaninnhold som gir skjærfleksibilitet under hjertesyklusen. Det ytre fibrosalaget ligger nær utstrømningsoverflaten på aortasiden og er rikt på type I og type III fibrillært kollagen som gir styrke til å opprettholde koaptasjon under diastolen10,11,12. VICs ligger i hvilemodus, men faktorer som betennelse, ombygging av den ekstracellulære matrisen (ECM) og mekanisk stress kan forstyrre VIC homeostase 8,9,13,14,15,16. Med tap av homeostase aktiverer og får VICs en myofibroblastlignende fenotype som er i stand til proliferasjon, sammentrekning og sekresjon av proteiner som ombygger den ekstracellulære millieu17. Aktiverte VIC kan gå over til forkalkningsceller som minner om differensieringen av en mesenkymal stamcelle (MSC) til en osteoblast 15,17,18,19,20,21,22,23,24,25.
Forkalkning ser ut til å initiere i det kollagenrike fibrosalaget fra bidrag fra både VEC og VICs, men utvider og invaderer de andre lagene i brosjyren8. Det er således klart at både VECs og VICs reagerer på stimuli for å oppregulere uttrykket av osteogene gener, men de nøyaktige hendelsene som driver aktiveringen av osteogene gener, samt det komplekse samspillet mellom cellene og den ekstracellulære matrisen i brosjyren, forblir dårlig definert. Murine modeller er ikke en ideell kilde for å studere ikke-genetiske drivere av CAVD patogenese, da mus ikke utvikler CAVD de novo26,27, derfor er bruk av primære humane vev og de primære cellelinjene isolert fra disse vevene nødvendig. Spesielt er det viktig å skaffe disse cellene i høyt antall og god kvalitet, da feltet 3D-cellekulturer og organoidmodellering utvides og sannsynligvis vil bli et ex vivo menneskebasert alternativ til murine modeller.
Hensikten med den nåværende metoden er å dele en arbeidsflyt som har etablert betingelsene for effektivt å isolere og vokse VECs og VICs hentet fra kirurgisk fjernede ventiler fra menneskelige givere. Tidligere studier har vist vellykket isolering av VEC og VIC fra svin28 og murine ventiler29, så vidt vi vet er dette den første som beskriver isoleringen av disse cellene i humant vev. Protokollen som er beskrevet her, gjelder for menneskelige utskårne ventiler og omgår og forbedrer skaden forårsaket av den ofte lange anskaffelsestiden mellom vevseksisjon og laboratoriebehandling ved å innføre bruk av en kald lagringsløsning, en bufret løsning klinisk utnyttet i organtransplantasjoner som i stor grad stabiliserer celler i det utskårne vevet. Protokollen beskrevet her viser også hvordan man bestemmer cellefenotype og garanterer høy effektivitet av celleoverlevelse med minimal cellekrysskontaminering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Innhenting av kontroll- og sykdomsvev fra mennesker er avgjørende for in vitro og ex vivo sykdomsmodellering; Men mens man ofte snakker om utfordringene med å bygge bro over gapet mellom benk til seng, er omvendt rekkefølge – å gå fra kirurgisk suite til benk – ofte like skremmende et gap. Viktig for en grunnleggende forsker for å skaffe primære menneskelige vevsprøver er et samarbeid med en investert kirurgforsker som har et team av sykepleiere, kirurgiske teknikere, legeassistenter, medisinske studenter og innb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Jason Dobbins for innsiktsfull diskusjon og kritisk lesning av dette manuskriptet. Vi vil gjerne anerkjenne Center for Organ Recovery and Education for deres hjelp og støtte og takke vevsdonorer og deres familier for å gjøre denne studien mulig. Alle pasientprøver er samlet inn fra personer som er registrert i studier godkjent av det institusjonelle vurderingsstyret ved University of Pittsburgh i samsvar med Helsinkideklarasjonen. Kadavervev oppnådd via Center for Organ Recovery and Education (CORE) ble godkjent av University of Pittsburgh Committee for Oversight of Research and Clinical Training Involving Decedents (CORID).
Noen figurer laget med Biorender.com.
CSH støttes av National Heart, Lung, and Blood Institute K22 HL117917 og R01 HL142932, American Heart Association 20IPA35260111.
Materials
| 0.45 μm filter | Thermo Scientific | 7211345 | Preparing plate with collagen coating |
| 10 cm cell culture plate | Greiner Bio-One | 664160 | Cell culture/cell line expansion |
| 10 mL serological pipet | Fisher | 14955234 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 1000 μL filter tips | VWR | 76322-154 | Cell culture/cell line expansion |
| 10XL filter tips | VWR | 76322-132 | Cell culture/cell line expansion |
| 15 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339650 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 16% paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | 15710S | Tissue and cell fixative |
| 190 proof ethanol | Decon | 2801 | Disinfection |
| 1x DPBS: no calcium, no magnesium | Gibco | 14190250 | Saline solution. VIC/VEC isolation |
| 1x PBS | Fisher | BP2944100 | Saline solution. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| 20 μL filter tips | VWR | 76322-134 | Cell culture/cell line expansion |
| 200 proof ethanol | Decon | 2701 | Deparaffinizing tissue samples |
| 2-propanol | Fisher | A416P 4 | Making collagen coated plates |
| 5 mL serological pipet | Fisher | 14955233 | VEC/VIC isolation, cell culture, cell line expansion |
| 50 mL conical tubes | Thermo Scientific | 339652 | Tissue storage, VIC/VEC isolation |
| 60 mm dish | GenClone | 25-260 | VEC isolation |
| 6-well cell culture plate | Corning | 3516 | Cell culture/cell line expansion |
| Acetic acid, glacial | Fisher | BP2401 500 | Making collagen coated plates |
| AlexaFluor 488 phalloidin | Invitrogen | A12379 | Fluorescent f-actin counterstain |
| Belzer UW Cold Storage Transplant Solution | Bridge to Life | BUW0011L | Tissue storage solution |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V – Fatty Acid Free 25g | Bioworld | 220700233 | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| Calponin 1 antibody | Abcam | ab46794 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| CD31 (PECAM-1) (89C2) | Cell Signaling | 3528 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| CD31+ Dynabeads | Invitrogen | 11155D | VEC confirmation with CD31+ Dynabeads |
| CDH5 | Cell Signaling | 2500 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Cell strainer with 0.70 μm pores | Corning | 431751 | VIC isolation |
| Collagen 1, rat tail protein | Gibco | A1048301 | Making collagen coated plates |
| Collagenase II | Worthington Biochemical Corporation | LS004176 | Tissue digestion. Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Conflikt Ready-to-use Disinfectant Spray | Decon | 4101 | Disinfection |
| Countess II Automated Cell Counter | Invitrogen | A27977 | Automated cell counter |
| Countess II reusable slide coverslips | Invitrogen | 2026h | Automated cell counter required slide cover |
| Coverslips | Fisher | 125485E | Mounting valve samples |
| Cryogenic vials | Olympus Plastics | 24-202 | Freezing cells/tissue samples |
| Disinfecting Bleach with CLOROMAX – Concentrated Formula | Clorox | N/A | Disinfection |
| DMEM | Gibco | 10569044 | Growth media. VIC expansion |
| EBM – Endothelial Cell Medium, Basal Medium, Phenol Red free 500 | Lonza Walkersville | CC3129 | Growth media. VEC expansion |
| EGM-2 Endothelial Cell Medium-2 – 1 kit SingleQuot Kit | Lonza Walkersville | CC4176 | Growth media supplement. VEC expansion |
| EVOS FL Microscope | Life Technologies | Model Number: AME3300 | Fluorescent imaging |
| EVOS XL Microscope | Life Technologies | AMEX1000 | Visualizing cells during cell line expansion |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | R&D Systems | S11550 | VIC expansion |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Fisherbrand Cell Scrapers | Fisher | 08-100-241 | VIC expansion |
| Fungizone | Gibco | 15290-026 | Antifungal: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | Antibiotic: Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Glass slides | Globe Scientific Inc | 1358L | mounting valve samples |
| Goat anti-Mouse 488 | Invitrogen | A11001 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Mouse 594 | Invitrogen | A11005 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | Fluorescent secondary Antibody |
| Goat anti-Rabbit 594 | Invitrogen | A11012 | Fluorescent secondary Antibody |
| Invitrogen Countess II FL Reusable Slide | Invitrogen | A25750 | Automated cell counter required slide |
| Invitrogen NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent (DAPI) | Invitrogen | R37606 | Fluorescent nucleus counterstain |
| LM-HyCryo-STEM – 2X Cryopreservation media for stem cells | HyClone Laboratories, Inc. | SR30002 | Frozen cell storage |
| Mounting Medium | Fisher Chemical Permount | SP15-100 | Mounting valve samples |
| Mr. Frosty freezing container | Nalgene | 51000001 | Container for controlled sample freezing |
| Mycoplasma-ExS Spray | PromoCell | PK-CC91-5051 | Disinfection |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | Antibiotic. VIC expansion |
| Plasmocin | Invivogen | ANTMPT | Anti-mycoplasma. VIC/VEC isolation and expansion |
| SM22a antibody | Abcam | ab14106 | Primary antibody (VIC positive stain) |
| Sstandard pattern scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Sterile cotton swab | Puritan | 25806 10WC | VEC isolation |
| Swingsette human tissue cassette | Simport Scientific | M515-2 | Tissue embedding container |
| Taylor Forceps (17cm) | Fine Science Tools | 11016-17 | Tissue preparation, VIC/VEC isolation |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | cell counting solution |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Splitting VIC/VECs |
| Von Kossa kit | Polysciences | 246331 | Staining paraffin sections of tissues for calcification |
| von Willebrand factor antibody | Abcam | ab68545 | Primary antibody (VEC positive stain) |
| Xylenes | Fisher Chemical | X3S-4 | Deparaffinizing tissue samples |
| αSMA antibody | Abcam | ab7817 | Primary antibody (VIC positive stain) |
References
- Lamprea-Montealegre, J. A., Otto, C. M. Health behaviors and calcific aortic valve disease. Journal of Amercan Heart Association. 7, (2018).
- Nishimura, R. A., et al. AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on practice guidelines. Circulation. 129, 2440-2492 (2014).
- Clark, M. A., et al. Clinical and economic outcomes after surgical aortic valve replacement in Medicare patients. Risk Manag Healthc Policy. 5, 117-126 (2012).
- Misfeld, M., Sievers, H. H. Heart valve macro- and microstructure. Philosophical Transactions of Royal Society of London B Biological Sciences. 362, 1421-1436 (2007).
- Anstine, L. J., Bobba, C., Ghadiali, S., Lincoln, J. Growth and maturation of heart valves leads to changes in endothelial cell distribution, impaired function, decreased metabolism and reduced cell proliferation. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 100, 72-82 (2016).
- Mahler, G. J., Butcher, J. T. Inflammatory regulation of valvular remodeling: the good(?), the bad, and the ugly. Internation Journal of Inflammation. 2011, 721419 (2011).
- Gould, S. T., Matherly, E. E., Smith, J. N., Heistad, D. D., Anseth, K. S. The role of valvular endothelial cell paracrine signaling and matrix elasticity on valvular interstitial cell activation. Biomaterials. 35, 3596-3606 (2014).
- Leopold, J. A. Cellular mechanisms of aortic valve calcification. Circulation: Cardiovascular Intervention. 5, 605-614 (2012).
- Chen, J. H., Simmons, C. A. Cell-matrix interactions in the pathobiology of calcific aortic valve disease: Critical roles for matricellular, matricrine, and matrix mechanics cues. Circulation Research. 108, 1510-1524 (2011).
- Sacks, M. S., Schoen, F. J., Mayer, J. E. Bioengineering challenges for heart valve tissue engineering. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 289-313 (2009).
- Taylor, P. M., Batten, P., Brand, N. J., Thomas, P. S., Yacoub, M. H. The cardiac valve interstitial cell. Internation Journal of Biochemistry and Cell Biology. 35, 113-118 (2003).
- Taylor, P. M., Allen, S. P., Yacoub, M. H. Phenotypic and functional characterization of interstitial cells from human heart valves, pericardium and skin. Journal of Heart Valve Disease. 9, 150-158 (2000).
- Rajamannan, N. M., et al. Calcific aortic valve disease: not simply a degenerative process: A review and agenda for research from the National Heart and Lung and Blood Institute Aortic Stenosis Working Group. Executive summary: Calcific aortic valve disease-2011 update. Circulation. 124, 1783-1791 (2011).
- Wang, H., Leinwand, L. A., Anseth, K. S. Cardiac valve cells and their microenvironment–insights from in vitro studies. Nature Reviews Cardiology. 11, 715-727 (2014).
- Yutzey, K. E., et al. Calcific aortic valve disease: a consensus summary from the Alliance of Investigators on Calcific Aortic Valve Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34, 2387-2393 (2014).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 317, 141-155 (2019).
- Liu, A. C., Joag, V. R., Gotlieb, A. I. The emerging role of valve interstitial cell phenotypes in regulating heart valve pathobiology. American Journal of Pathology. 171, 1407-1418 (2007).
- Liu, A. C., Gotlieb, A. I. Characterization of cell motility in single heart valve interstitial cells in vitro. Histology and Histopathology. 22, 873-882 (2007).
- Yip, C. Y., Chen, J. H., Zhao, R., Simmons, C. A. Calcification by valve interstitial cells is regulated by the stiffness of the extracellular matrix. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29, 936-942 (2009).
- Song, R., Fullerton, D. A., Ao, L., Zhao, K. S., Meng, X. An epigenetic regulatory loop controls pro-osteogenic activation by TGF-beta1 or bone morphogenetic protein 2 in human aortic valve interstitial cells. Journal of Biological Chemistry. 292, 8657-8666 (2017).
- Xu, M. H., et al. Absence of the adenosine A2A receptor confers pulmonary arterial hypertension and increased pulmonary vascular remodeling in mice. Journal of Vascular Research. 48, 171-183 (2011).
- Jian, B., Narula, N., Li, Q. Y., Mohler, E. R., Levy, R. J. Progression of aortic valve stenosis: TGF-beta1 is present in calcified aortic valve cusps and promotes aortic valve interstitial cell calcification via apoptosis. Annals of Thoracic Surgery. 75, 465 (2003).
- Bogdanova, M., et al. Interstitial cells in calcified aortic valves have reduced differentiation potential and stem cell-like properties. Science Reports. 9, 12934 (2019).
- Gendron, N., et al. Human aortic valve interstitial cells display proangiogenic properties during calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (1), 415-429 (2021).
- Wirrig, E. E., Yutzey, K. E. Conserved transcriptional regulatory mechanisms in aortic valve development and disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 737-741 (2014).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 34, 270-278 (2014).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310 (2011).
- Gould, R. A., Butcher, J. T. Isolation of valvular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (46), e2158 (2010).
- Miller, L. J., Lincoln, J. Isolation of murine valve endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (90), e51860 (2014).
- Selig, J. I., et al. Impact of hyperinsulinemia and hyperglycemia on valvular interstitial cells – A link between aortic heart valve degeneration and type 2 diabetes. Biochimica Biophysica Acta Molecular Basis of Disease. 1865, 2526-2537 (2019).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protocols. 2008, (2008).
- Martinsson, A., et al. Temporal trends in the incidence and prognosis of aortic stenosis: A nationwide study of the Swedish population. Circulation. 131, 988-994 (2015).
- Rabkin-Aikawa, E., Farber, M., Aikawa, M., Schoen, F. J. Dynamic and reversible changes of interstitial cell phenotype during remodeling of cardiac valves. Journal of Heart Valve Diseases. 13, 841-847 (2004).
- St Hilaire, C., Carroll, S. H., Chen, H., Ravid, K. Mechanisms of induction of adenosine receptor genes and its functional significance. Journal of Cell Physiology. 218, 35-44 (2009).
- Xu, K., et al. Cell-type transcriptome atlas of human aortic valves reveal cell heterogeneity and endothelial to mesenchymal transition involved in calcific aortic valve disease. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 40, 2910-2921 (2020).
