Análise de rastreamento de nanopartículas para a quantificação e determinação de tamanho de vesículos extracelulares

Summary

Demonstramos como usar um novo instrumento de análise de rastreamento de nanopartículas para estimar a distribuição de tamanho e concentração total de partículas de vesículas extracelulares isoladas do tecido adiposo de camundongos e plasma humano.

Abstract

Os papéis fisiológicos e fisiofisiológicos de vesículas extracelulares (EVs) tornaram-se cada vez mais reconhecidos, tornando o campo EV uma área de pesquisa em rápida evolução. Existem muitos métodos diferentes para o isolamento do EV, cada um com vantagens e desvantagens distintas que afetam o rendimento a jusante e a pureza dos EVs. Assim, caracterizar a preparação de EV isolada de uma determinada fonte por um método escolhido é importante para a interpretação dos resultados a jusante e comparação dos resultados entre laboratórios. Existem vários métodos para determinar o tamanho e a quantidade de EVs, que podem ser alterados por estados da doença ou em resposta a condições externas. A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é uma das tecnologias proeminentes utilizadas para análise de alto rendimento de EVs individuais. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para quantificação e determinação de tamanho de EVs isolados do tecido adiposo do rato e plasma humano usando uma tecnologia inovadora para a NTA representando grandes avanços no campo. Os resultados demonstram que este método pode fornecer dados de concentração de partículas e tamanho totais reprodutíveis e válidos para EVs isolados de diferentes fontes usando diferentes métodos, conforme confirmado pela microscopia eletrônica de transmissão. A adaptação deste instrumento para a NTA abordará a necessidade de padronização nos métodos NTA para aumentar o rigor e a reprodutibilidade na pesquisa de EV.

Introduction

As vesículas extracelulares (EVs) são pequenas (0,03-2 μm) de vesículas ligadas à membrana secretadas por quase todos os tipos de células¹. Eles são frequentemente referidos como “exossomos”, “microvesículos” ou “corpos apoptóticos” dependendo de seu mecanismo de liberação e tamanho². Embora inicialmente se pensasse que os EVs eram simplesmente um meio de eliminar resíduos da célula para manter a homeostase³, agora sabemos que eles também podem participar da comunicação intercelular via transferência de material molecular – incluindo DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipídios e proteínas^4,5 – e que eles são importantes reguladores da fisiologia normal, bem como processos patológicos^{1, 5,6,7,8}.

Existem muitos métodos diferentes para isolar e quantificar EVs, que foram descritos em outros lugares^9,10,11,12. O protocolo de isolamento usado, bem como a fonte de EVs, podem impactar muito o rendimento e a pureza do EV. Mesmo a centrifugação diferencial, considerada por muito tempo a abordagem “padrão-ouro” para o isolamento exóssomo, pode estar sujeita a variabilidade substancial, impactando posteriormente a população de EV obtida e análises a jusante¹³. Assim, as diferentes metodologias de isolamento e quantificação do EV dificultam a comparação, reprodução e interpretação dos resultados dos experimentos relatados na literatura¹⁴. Além disso, a liberação de EV pode ser regulada por condições celulares ou vários fatores externos. Tem sido sugerido que os EVs desempenham um papel na manutenção da homeostase celular protegendo as células contra o estresse intracelular^15,como vários estudos têm mostrado que o estresse celular estimula a secreção de EV. Por exemplo, o aumento da liberação de EV foi relatado após exposição celular à hipóxia, estresse órticulo endoplasmático, estresse oxidativo, estresse mecânico, extrato de fumaça de cigarro e poluição atmosférica de material particulado^{16,17,18,19,20,21,22}. A versão eV também foi mostrada como modificada in vivo; camundongos submetidos a uma dieta rica em gordura ou jejum por dezesseis horas liberaram mais EVs adipócitos²³. Para investigar se um tratamento ou condição específico altera a liberação do EV, o número de EVs deve ser determinado com precisão. A avaliação da distribuição do tamanho do EV também pode indicar a origem subcelular predominante dos EVs (por exemplo, fusão de endosomes/corpos multivesiculares tardios com a membrana plasmática versus brotação da membrana plasmática)²⁴. Assim, há necessidade de métodos robustos para medir com precisão a concentração total e a distribuição de tamanho da preparação de EV que está sendo estudada.

Um método rápido e altamente sensível para a visualização e caracterização de EVs na solução é a análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Uma explicação detalhada dos princípios deste método e a comparação com métodos alternativos de avaliação do tamanho e concentração de EV foram descritas anteriormente^25,26,27,28. Resumidamente, durante a medição da NTA, os EVs são visualizados pela luz espalhada quando são irradiados com um raio laser. A luz dispersa é focada por um microscópio em uma câmera que registra o movimento das partículas. O software NTA rastreia o movimento térmico aleatório de cada partícula, conhecido como movimento browniano, para determinar o coeficiente de difusão que é usado para calcular o tamanho de cada partícula usando a equação de Stokes-Einstein. A NTA foi aplicada pela primeira vez à medição de EVs em uma amostra biológica em 2011²⁵. Até recentemente, havia apenas duas empresas tradicionais oferecendo instrumentos NTA comerciais²⁹ até a introdução do ViewSizer 3000 (doravante chamado de instrumento de rastreamento de partículas) que usa uma combinação de novas soluções de hardware e software para superar limitações significativas de outras técnicas NTA.

O instrumento de rastreamento de partículas caracteriza nanopartículas em amostras líquidas analisando seu movimento browniano e caracteriza partículas maiores do tamanho de micron, analisando a fixação gravitacional. O sistema óptico único deste instrumento, que inclui iluminação multiespectral com três fontes de luz laser (a 450 nm, 520 nm e 635 nm), permite que os pesquisadores analisem uma ampla gama de tamanhos de partículas (por exemplo, exosósmos, microvesculas) simultaneamente. Um esquema da configuração do instrumento é mostrado na Figura 1.

Aqui, demonstramos como realizar a distribuição de tamanho de partículas e medições de concentração de mouses isolados e EVs humanos usando um novo instrumento NTA.

Figura 1: Sistema óptico do instrumento de rastreamento de partículas. O instrumento NTA ilumina partículas usando três lasers com os seguintes comprimentos de onda: 450 nm, 520 nm, 635 nm. A gravação de vídeo da luz dispersa de partículas individuais é detectada e rastreada por uma câmera de vídeo digital orientada a 90° do cuvette. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

Todos os trabalhos com essas amostras foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais e do Conselho de Revisão Institucional. Uma visão geral esquemática do método NTA é retratada na Figura 2. Figura 2: Visão geral do método NTA utilizando o instru…

Representative Results

Antes desta demonstração, a calibração do instrumento foi testada pela primeira vez para garantir a validade dos dados adquiridos, medindo a distribuição de tamanho das normas de contas de poliestireno. Testamos a distribuição de tamanho de contas de 100 nm e 400 nm usando os parâmetros de gravação padrão e as configurações de processamento recomendadas neste protocolo(Figura 8). Para o padrão de contas de poliestireno de 100 nm, foi medida uma conc…

Discussion

Aqui, demonstramos um protocolo para nta de EVs medir a distribuição de tamanho de uma ampla gama de tamanhos de partículas simultaneamente e medir a concentração total de EV em uma amostra de polidisperse. Neste estudo, o tecido adiposo do rato perigonadal e o plasma humano foram usados como fonte de EVs. No entanto, EVs isolados de outros tecidos ou fluidos biológicos, como soro, urina, saliva, leite materno, fluido amniótico e supernanato de cultura celular também podem ser usados para NTA. As medições das n…

Materials

1X dPBS	VWR	02-0119-1000	To dilute samples
100 nm bead standard	Thermo Scientific	3100A	To test ViewSizer 3000 calibration
400 nm bead standard	Thermo Scientific	3400A	To test ViewSizer 3000 calibration
Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC901024	To filter PBS diluent
Collection tubes, 2 mL	Qiagen	19201	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Compressed air duster	DustOff	DPSJB-12	To clean cuvettes
Cuvette insert	HORIBA Scientific	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Cuvette jig	HORIBA Scientific	–	To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000
De-ionized water	VWR	02-0201-1000	To clean cuvettes
Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables	Dell	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%)	Millipore Sigma	–	To clean cuvettes
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Glass scintillation vials with lids	Thermo Scientific	B780020	To clean cuvettes
"Hook" tool	Excelta	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Lint-free microfiber cloth	Texwipe	TX629	To clean cuvettes and cover work surface
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	22363344	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Stir bar	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Quartz cuvette with cap	Agilent Technologies	AG1000-0544	Initially provided with purchase of ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	–	Nanoparticle tracking instrument