Nanopartikler Tracking Analyse for kvantificering og størrelse bestemmelse af ekstracellulære vesikler

Summary

Vi demonstrerer, hvordan man bruger et nyt nanopartikler tracking analyseinstrument til at estimere størrelsesfordelingen og den samlede partikelkoncentration af ekstracellulære vesikler isoleret fra mus perigonadal fedtvæv og human plasma.

Abstract

De fysiologiske og patofysiologiske roller ekstracellulære vesikler (elbiler) er blevet mere og mere anerkendt, hvilket gør EV-feltet til et hurtigt udviklende forskningsområde. Der er mange forskellige metoder til EV isolation, hver med forskellige fordele og ulemper, der påvirker downstream udbytte og renhed af elbiler. Således er det vigtigt at karakterisere EV-prep isoleret fra en given kilde ved en valgt metode for fortolkning af downstream-resultater og sammenligning af resultater på tværs af laboratorier. Der findes forskellige metoder til bestemmelse af elbilers størrelse og mængde, som kan ændres af sygdomstilstande eller som reaktion på eksterne forhold. Nanopartikler tracking analyse (NTA) er en af de fremtrædende teknologier, der anvendes til high-throughput analyse af individuelle elbiler. Her præsenterer vi en detaljeret protokol til kvantificering og størrelsesbestemmelse af elbiler isoleret fra musesyigonadal fedtvæv og humant plasma ved hjælp af en banebrydende teknologi til NTA, der repræsenterer store fremskridt på området. Resultaterne viser, at denne metode kan levere reproducerbare og gyldige samlede partikelkoncentrations- og størrelsesfordelingsdata for elbiler isoleret fra forskellige kilder ved hjælp af forskellige metoder, som bekræftet af transmissionselektronmikroskopi. Tilpasningen af dette instrument til NTA vil tage fat på behovet for standardisering i NTA-metoder for at øge strengheden og reproducerbarheden i ev-forskning.

Introduction

Ekstracellulære vesikler (elbiler) er små (0,03-2 μm) membranbundne vesikler, der udskilles af næsten alle celletyper¹. De omtales ofte som “exosomer”, “mikrovesicles” eller “apoptotiske kroppe” afhængigt af deres frigivelsesmekanisme og størrelse². Mens det oprindeligt blev antaget, at elbiler simpelthen var et middel til at fjerne affald fra cellen for at opretholde homøostase³, ved vi nu, at de også kan deltage i intercellulær kommunikation via overførsel af molekylært materiale – herunder DNA, RNA (mRNA, microRNA), lipider og proteiner^4,5 – og at de er vigtige regulatorer af normal fysiologi samt patologiske processer^{1, 5,6,7,8}.

Der findes mange forskellige metoder til at isolere og kvantificere elbiler, som er beskrevet andetsteds^9,10,11,12. Den anvendte isolationsprotokol samt kilden til elbiler kan i høj grad påvirke EV udbytte og renhed. Selv differentieret centrifugering, der længe har været betragtet som “guldstandardmetoden” for eksosome isolation, kan være genstand for betydelig variation, der efterfølgende påvirker den opnåede EV-population, og downstream-analyser¹³. Således gør de forskellige forskellige metoder til EV isolation og kvantificering det vanskeligt at sammenligne, reproducere og fortolke resultaterne af eksperimenter rapporteret i litteraturen¹⁴. Desuden kan EV-frigivelse reguleres af cellulære forhold eller forskellige eksterne faktorer. Det er blevet foreslået, at elbiler spiller en rolle i at opretholde cellulære homøostase ved at beskytte celler mod intracellulær stress¹⁵, som flere undersøgelser har vist, at cellulær stress stimulerer EV sekretion. For eksempel er øget EV-frigivelse blevet rapporteret efter cellulær eksponering for hypoxi, endoplasmisk reticulum stress, oxidativ stress, mekanisk stress, cigaretrøg ekstrakt, og partikler luftforurening^{16,17,18,19,20,21,22}. Ev frigivelse har også vist sig at være ændret in vivo; mus, der er udsat for en kost med højt fedtindhold eller faste i seksten timer, frigav flere adipocyt-elbiler²³. For at undersøge, om en bestemt behandling eller tilstand ændrer EV-frigivelsen, skal antallet af elbiler bestemmes nøjagtigt. Vurderingen af fordelingen af ev-størrelsen kan også indikere den fremherskende subcellulære oprindelse af elbiler (f.eks. fusion af sene endoomer/multivesikulære organer med plasmamembranen vs. spirende plasmamembran)²⁴. Der er således behov for robuste metoder til nøjagtigt at måle den samlede koncentration og størrelsesfordelingen af den EV-forberedelse, der undersøges.

En hurtig og meget følsom metode til visualisering og karakterisering af elbiler i opløsning er nanopartikler tracking analyse (NTA). En detaljeret forklaring af principperne i denne metode og sammenligning med alternative metoder til vurdering af EV’s størrelse og koncentration er tidligere blevet beskrevet^25,26,27,28. Kort sagt, under NTA måling, elbiler visualiseres af lyset spredt, når de er bestrålet med en laserstråle. Det spredte lys er fokuseret af et mikroskop på et kamera, der registrerer partikelbevægelsen. NTA-softwaren sporer den tilfældige termiske bevægelse af hver partikel, kendt som Brownian motion, for at bestemme diffusionskoefficienten, der bruges til at beregne størrelsen af hver partikel ved hjælp af Stokes-Einstein-ligningen. NTA blev første gang anvendt til måling af elbiler i en biologisk prøve i 2011²⁵. Indtil for nylig var der kun to mainstream virksomheder, der tilbyder kommercielle NTA instrumenter²⁹ indtil indførelsen af ViewSizer 3000 (i det følgende benævnt partikel tracking instrument), som bruger en kombination af nye hardware og softwareløsninger til at overvinde betydelige begrænsninger af andre NTA teknikker.

Partikelsporingsinstrumentet karakteriserer nanopartikler i flydende prøver ved at analysere deres Brownian bevægelse og karakteriserer større mikron-størrelse partikler ved at analysere gravitationel afregning. Dette instruments unikke optiske system, som omfatter multispektral belysning med tre laserlyskilder (ved 450 nm, 520 nm og 635 nm), gør det muligt for forskere at analysere en bred vifte af partikelstørrelser (f.eks. exosomer, mikrovesicles) samtidigt. Der vises et skema over instrumentopsætningen i figur 1.

Her demonstrerer vi, hvordan man udfører partikelstørrelsesfordeling og koncentrationsmålinger af isolerede mus og menneskelige elbiler ved hjælp af et nyt NTA-instrument.

Figur 1: Partikelsporingsinstrument optisk system. NTA-instrumentet belyser partikler ved hjælp af tre lasere med følgende bølgelængder: 450 nm, 520 nm, 635 nm. Videooptagelse af det spredte lys fra individuelle partikler registreres og spores af et digitalt videokamera orienteret 90° fra cuvette. Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

Alt arbejde med disse prøver blev udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee og Institutional Review Board retningslinjer. En skematisk oversigt over NTA-metoden er afbildet i figur 2. Figur 2: Oversigt over NTA-metoden ved hjælp af partikelsporingsinstrumentet. Prøve…

Representative Results

Før denne demonstration blev kalibreringen af instrumentet først testet for at sikre gyldigheden af de erhvervede data ved at måle størrelsesfordelingen af polystyrenperlestandarder. Vi testede størrelsesfordelingen af 100 nm og 400 nm perler ved hjælp af standardregistreringsparametrene og de behandlingsindstillinger, der anbefales i denne protokol (Figur 8). For polystyrenperens standard på 100 nm blev der målt en koncentration på 4,205 x 107…

Discussion

Her demonstrerer vi en protokol for NTA af elbiler for at måle størrelsesfordelingen af en bred vifte af partikelstørrelser samtidigt og måle den samlede EV-koncentration i en polydispersprøve. I denne undersøgelse blev musemaigonadal fedtvæv og humant plasma brugt som kilde til elbiler. Men, Elbiler isoleret fra andre væv eller biologiske væsker såsom serum, urin, spyt, modermælk, fostervand, og celle kultur supernatant kan også anvendes til NTA. Målinger af polystyrenperlestandarder sikrede, at instrumente…

Materials

1X dPBS	VWR	02-0119-1000	To dilute samples
100 nm bead standard	Thermo Scientific	3100A	To test ViewSizer 3000 calibration
400 nm bead standard	Thermo Scientific	3400A	To test ViewSizer 3000 calibration
Centrifugal Filter Unit	Amicon	UFC901024	To filter PBS diluent
Collection tubes, 2 mL	Qiagen	19201	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Compressed air duster	DustOff	DPSJB-12	To clean cuvettes
Cuvette insert	HORIBA Scientific	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Cuvette jig	HORIBA Scientific	–	To align magnetic stir bar while placing inserts inside cuvette; Provided with purchase of ViewSizer 3000
De-ionized water	VWR	02-0201-1000	To clean cuvettes
Desktop computer with monitor, keyboard, mouse, and all necessary cables	Dell	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Ethanol (70-100%)	Millipore Sigma	–	To clean cuvettes
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Glass scintillation vials with lids	Thermo Scientific	B780020	To clean cuvettes
"Hook" tool	Excelta	–	Provided with purchase of ViewSizer 3000
Lint-free microfiber cloth	Texwipe	TX629	To clean cuvettes and cover work surface
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	22363344	For isolation of human plasma extracellular vesicles
Stir bar	Sp Scienceware	F37119-0005
Suprasil Quartz cuvette with cap	Agilent Technologies	AG1000-0544	Initially provided with purchase of ViewSizer 3000
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	–	Nanoparticle tracking instrument