Ce protocole fournit des étapes détaillées pour une tâche de localisation d’objet avec quatre répétitions utilisant la même cohorte de rats. Un encodage faible et fort peut produire des souvenirs à court et à long terme. La flexibilité du protocole avec répétition peut être bénéfique pour les études impliquant des opérations chirurgicales en économisant du temps et de la main-d’œuvre.
La reconnaissance de la place des objets est une méthode importante utilisée pour étudier la mémoire spatiale chez les rongeurs. Cette mémoire de reconnaissance de lieu d’objet constitue la base de la tâche d’emplacement d’objet. Cet article fournit un protocole complet pour guider l’établissement d’une tâche de localisation d’objet avec l’option de jusqu’à quatre répétitions utilisant la même cohorte de rats. Les protocoles d’encodage faibles et forts peuvent être utilisés pour étudier les mémoires spatiales à court et à long terme de force variable et pour permettre la mise en œuvre de manipulations pertinentes inhibant ou améliorant la mémoire. De plus, la répétition du test avec le contrepoids présenté ici permet la combinaison des résultats de deux tests ou plus pour la comparaison à l’intérieur du sujet afin de réduire la variabilité entre les rats. Cette méthode aide à augmenter la puissance statistique et est fortement recommandée, en particulier lors de l’exécution d’expériences qui produisent une forte variation dans le comportement individuel. Cela affine directement l’étude en augmentant les données obtenues auprès de chaque animal et en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires. Enfin, la mise en œuvre de la tâche répétée de localisation d’objets augmente l’efficacité des études impliquant des procédures chirurgicales en économisant du temps et de la main-d’œuvre.
Les tâches de reconnaissance spontanée(p. ex., reconnaissance d’objets, reconnaissance de lieux d’objets) ont été utilisées dans une large mesure dans l’étude de la mémoire chez les rongeurs. Ces tests sont différents de la variété de tests utilisés pour évaluer la mémoire qui sont basés sur le conditionnement de la peur ou la motivation de récompense, en ce sens que les tâches de reconnaissance spontanée sont basées uniquement sur un comportement exploratoire spontané envers de nouveaux stimuli. Ce comportement, appelé « préférence néotique »1,est inhérent aux rongeurs ainsi qu’à d’autres espèces de mammifères et à certains non-mammifères tels que les oiseaux et les poissons2. La reconnaissance de place d’objet, qui dépend de la mémoire spatiale, peut être observée à l’aide de la tâche d’emplacement d’objet (également appelée tâche de reconnaissance d’objet spatial)3. Des études de lésions ont montré que la reconnaissance du lieu de l’objet nécessite un hippocampe intact4,5. En raison du protocole d’entraînement relativement simple et de l’absence de tout renforcement, cette tâche est préférable dans de nombreuses études. L’absence de renforcement positif et négatif minimise les paramètres supplémentaires et les régions du cerveau qui pourraient conduire le comportement. Par conséquent, le comportement ici est neutre et est basé sur la curiosité et la mémoire spatiale, permettant l’étude des mécanismes impliqués dans l’encodage, la consolidation et la récupération de la mémoire spatiale.
Le protocole pour la tâche de localisation d’objet se compose généralement de sessions d’accoutumance suivies d’une seule session d’encodage et d’essais de test, séparées par une période de retard, qui varie de plusieurs minutes à quelques heures. Il est fortement recommandé de manipuler les rats au préalable pour minimiser le niveau de stress des animaux et, par conséquent, les comportements qui pourraient affecter la mémoire de reconnaissance, tels que l’aversion pour la nouveauté. De même, un protocole d’accoutumant bien conçu joue un rôle essentiel dans la prévention du stress qui pourrait entraver le comportement naturel du rat pendant la tâche. Cependant, l’étendue de la manipulation et de l’accoutumant varie largement entre les laboratoires et les expérimentateurs, ce qui peut contribuer à une faible reproductibilité6,7,8. Dans l’essai d’encodage, le rat a le temps d’explorer une arène avec deux objets identiques situés dans deux coins désignés. Dans l’essai test, qui est retardé d’une période, le rat a le temps d’explorer l’arène avec la même paire d’objets, mais cette fois l’un d’eux a été déplacé vers un nouvel endroit. La préférence spontanée manifestée par les rats et l’augmentation du temps passé à explorer l’objet à l’emplacement nouveau qui en résulte sont révélatrices de la reconnaissance spatiale et de la mémoire des emplacements de l’objet3. La modification de l’essai d’encodage (durée et nombre de répétitions) influence la force de la mémoire.
Selon l’objectif de l’étude, la durée du délai entre l’encodage et les essais peut être modifiée pour modéliser la mémoire à court terme indépendante de la synthèse des protéines ou la mémoire à long terme dépendante de la synthèse des protéines. Par conséquent, la tâche de localisation de l’objet peut être utilisée pour une grande variété d’études en adaptant le protocole au besoin. En outre, la mise en œuvre de manipulations expérimentales, telles que des interventions pharmacologiques et optogénétiques, est également possible entre ces essais, tout comme l’imagerie in vivo. Il existe plusieurs études9,10 qui rapportent des itérations répétées de la tâche de localisation de l’objet au sein de la même cohorte de rats. Cela contraste avec l’utilisation traditionnelle dans laquelle un animal a une séance sans répétitions. Cependant, l’efficacité de ces paradigmes n’a pas été étudiée de manière approfondie, et il n’existe aucun document de méthode les décrivant. À notre connaissance, il s’agit de la première description rapportée d’un protocole qui décrit en détail une tâche de localisation d’objet avec jusqu’à quatre répétitions utilisant la même cohorte de rats, qui compare également systématiquement les résultats de chaque répétition. Les répétitions peuvent être utilisées pour contrebalancer les conditions expérimentales afin de permettre une comparaison à l’intérieur du sujet avec une variabilité réduite entre les tests. La répétition fiable de la tâche permet de mettre en commun les données, ce qui signifie qu’une quantité suffisante de données peut être générée à l’aide d’un nombre relativement faible de rats. Enfin, les répétitions utilisant le même rat peuvent être bénéfiques dans les expériences impliquant des opérations chirurgicales et des implantations en réduisant le nombre de rats requis qui, par conséquent, permet d’économiser du temps et des coûts de main-d’œuvre.
Cette étude présente un protocole détaillé détaillant comment effectuer une tâche de localisation d’objet chez des rats adultes en utilisant des essais de codage forts et faibles suivis d’essais avec des retards de 1 h et 24 heures. Le protocole d’encodage puissant produit une mémoire de reconnaissance statistiquement significative lorsqu’il est testé avec des retards de 1 h et 24 heures et peut donc être utilisé pour étudier les souvenirs à court et à long terme lors de la mise en œuvre de manipulations pour inhiber ces souvenirs11. En revanche, le protocole d’encodage faible ne produit une mémoire à court terme significative que lorsqu’il est testé avec un délai de 1 h. L’absence de mémoire à long terme peut être utilisée pour étudier les manipulations visant à améliorer la rétention de la mémoire11,12. Ce protocole inclut également des sessions de manipulation et d’accoutumage détaillées, qui visent à augmenter la reproductibilité de la tâche d’emplacement de l’objet. Cet article démontre également la répétition de la tâche dans quatre contextes distincts avec la même cohorte de rats en utilisant le protocole de codage faible, qui est confirmé pour produire des résultats reproductibles et cohérents à chaque fois.
La tâche de localisation d’objet peut être utilisée dans diverses études pour étudier la mémoire spatiale comme décrit précédemment. La flexibilité de la configuration permet la modélisation de la mémoire à court et à long terme de différentes forces, et elle peut être facilement mise en œuvre à faible coût. Cependant, comme il existe de nombreux paramètres dans le protocole qui peuvent influencer les résultats, et que différentes études varient légèrement dans ces paramètres6, on peut rencontrer des difficultés à mettre en œuvre la tâche avec succès pour la première fois. Le protocole ci-dessus est destiné à guider les lecteurs tout au long de ce processus en douceur. D’autres étapes cruciales qui pourraient être importantes dans la mise en œuvre réussie de la tâche avec une grande reproductibilité seront discutées ci-dessous.
Bien que la session d’encodage / test soit souvent au centre de l’exécution d’expériences de localisation d’objets, les protocoles de manipulation et d’accoutumant ont un effet profond sur le résultat de ce type de tests comportementaux où le résultat dépend du comportement naturel non perturbé du rat14,15. En tant que telles, les étapes précédant la session d’encodage / test doivent être conçues avec prudence, car elles peuvent influencer le comportement et la mémoire du rat et, par conséquent, influencer les résultats finaux. Un bon niveau de manipulation et d’accoutumant de sorte que les rats se familiarisent avec l’expérimentateur et la tâche minimisera l’effet des facteurs de stress tout en augmentant la probabilité de présenter un comportement naturel8. Comme mentionné dans le protocole, la manipulation peut commencer dès le sevrage des petits si la souche de rat est maintenue dans l’établissement à domicile. Sur la base de l’expérience antérieure (données non présentées) et de celle de plusieurs études antérieures16,17, cette manipulation précoce entraîne une faible anxiété et une curiosité accrue dans les mois qui suivent.
Comme la tâche de localisation de l’objet dépend uniquement de l’entraînement exploratoire intrinsèque des rats, le comportement attendu peut être facilement entravé si les rats ne sont pas désireux d’explorer ou réticents à approcher la nouveauté, ce que l’on appelle le « comportement néophobe »1. En tant que tel, il est fortement recommandé d’inclure un protocole de manipulation et d’accoutumant approfondi en fonction des besoins spécifiques de l’étude. Ce protocole peut être utilisé comme guide des exigences minimales et d’autres étapes peuvent être mises en œuvre(par exemple,si l’étude doit inclure des injections à un stade ultérieur, une accoutumée aux procédures d’injection et une position de maintien spécifique sont requises). La souche et l’âge des rats expérimentaux sont deux autres facteurs influents et doivent être pris en compte avant de planifier une expérience pour éviter des résultats sous-optimaux. Différentes souches de rats peuvent avoir des comportements et des niveaux d’anxiété de basedifférents 18,19,20 et, par conséquent, un ajustement spécifique au protocole peut être nécessaire en fonction de la souche utilisée.
Il est confirmé que ce protocole fonctionne bien avec les rats transgéniques Th-Cre avec la souche Long-Evans croisée quatre fois avec la souche Lister Hooded et les rats Lister Hooded de type sauvage. Un âge de départ logiquement idéal pour les rats dans les expériences comportementales est d’environ 12 semaines20, mais la variabilité entre les souches et les exigences spécifiques de la tâche doivent être prises en compte. Il pourrait également être possible d’utiliser des rats en développement si cela présente un intérêt pour l’étude, bien que des ajustements au protocole puissent être nécessaires et ne soient pas couverts ici. Cependant, il est important de déterminer si le rat à un âge donné a développé les fonctions cognitives nécessaires pour effectuer avec succès cette tâche. Une étude21 portant sur ce sujet a rapporté que seuls les rats adolescents au 38e jour postnatal et non avant, ont montré une mémoire spatiale allocentrique reflétée dans la préférence pour l’objet au nouvel emplacement, comme observé chez les rats adultes. Le protocole présenté ici a été couronné de succès en utilisant des rats âgés de 15 à 16 semaines au début de la première session d’encodage / test. Auparavant, le même protocole d’encodage fort produisait des résultats sous-optimaux à négatifs lors de l’utilisation de rats âgés de 23 semaines qui n’avaient pas atteint le niveau optimal d’accoutumant en raison du manque de manipulation et d’accoutumant à un âge suffisamment jeune. Ces rats n’ont pas réussi à performer différemment du niveau du hasard ou, en fait, ont montré une aversion pour la nouveauté observée en termes de préférence pour les objets stables au lieu des objets déplacés (données non montrées). Ces résultats fournissent la preuve que l’âge et le moment de l’accoutumance à la manipulation peuvent avoir un impact sur l’efficacité de l’accoutumance et, par conséquent, contribuer à l’observation d’un comportement anxieux et néophobe dans les tests.
Ici, deux protocoles différents sont décrits, assurant un encodage fort ou faible dans la tâche d’emplacement de l’objet. Au cours de l’établissement de ces protocoles, il a été observé que l’intérêt pour les objets a diminué après 5 à 10 minutes d’exploration au cours d’essais longs uniques(par exemple, 20 minutes d’encodage), et les rats ont finalement cessé d’explorer. Il en résulte une mémoire plus faible des emplacements des objets. Un protocole d’encodage qui entrelace les essais de codage avec de courtes périodes de repos(par exemple, un codage de 3 x 5 minutes) surmonte ce problème et conduit à une exploration élevée tout au long des essais. Ainsi, le temps d’exploration actif et la disposition différente de ces deux protocoles d’encodage influencent la force de la mémoire, qui est plus forte après 3 x 5 min d’encodage qu’après des protocoles d’encodage de 20 min. Des résultats similaires peuvent également être obtenus en utilisant des durées légèrement différentes avec des protocoles d’essai uniques par rapport à des protocoles d’essai entrelacés, et des ajustements peuvent être apportés pour répondre aux besoins de l’étude et de la souche de rat.
Contrairement aux protocoles utilisant un champ ouvert blanc uni avec seulement des signaux externes dans la pièce, le protocole présenté ici utilise une arène avec des contextes distincts et des indices intra-labyrinthe qui nécessite probablement plus de temps pour apprendre. Par conséquent, l’ajout d’une étape d’accoutumabilité du contexte dans le protocole avant l’essai de codage est recommandé. Cela permettra aux rats de former une carte spatiale de chaque contexte pendant l’accoutumant et de réduire la durée de l’essai de codage suivant, car les rats n’auront qu’à coder les emplacements des objets par rapport à cette carte. De plus, l’accoutumation du contexte permettra aux rats de s’habituer à tout distracteur possible dans chaque contexte, comme les signaux spatiaux 3D, minimisant ainsi les comportements autres que l’exploration d’objets dans la session d’encodage / test à suivre. Avec la mise en œuvre d’une méthode de contrepoids approfondie composée de plusieurs niveaux(c’est-à-dire un large éventail de combinaisons d’emplacement d’objet (compteurs) et de direction du déplacement de l’objet), les préférences indésirables qui peuvent augmenter en raison des variations de l’intensité lumineuse et des couleurs / motifs muraux aux coins de l’arène sont minimisées.
Plusieurs facteurs doivent être pris en compte lors de la répétition de la tâche pour augmenter la reproductibilité entre les sessions d’encodage / test et minimiser l’influence de la répétition. Tout d’abord, des contextes distincts (jusqu’au nombre de répétitions de sessions d’encodage/test) doivent être conçus pour éviter l’accumulation de mémoire spatiale qui pourrait être causée par l’exécution des sessions répétées en utilisant le même contexte. Pour ce faire, un appareil avec des parois remplaçables de différentes couleurs et motifs a été utilisé (Figure 1B, C). Les murs distincts et les objets 3D (tels que des jouets ou de petits objets du quotidien de couleurs et de formes distinctes, voir protocole et figure 1C)accrochés aux murs sont les repères spatiaux et les points de repère que les rats utilisent potentiellement pour apprendre l’emplacement des objets par rapport à leurs contextes. Dans le cas où un test ne parvient pas à produire une préférence pour l’objet déplacé, la modification de ces paramètres du contexte (conception du mur et repères spatiaux) peut être envisagée. Alternativement, une arène de forme rectangulaire ou circulaire peut être utilisée pour des tâches de localisation d’objets au lieu d’une arène carrée comme dans ce protocole. Les arènes circulaires élimineraient les préférences de coin22 qui sont souvent observées dans les arènes avec des coins, et par conséquent, cela peut être bénéfique lorsqu’il s’agit d’une souche de rat ou de souris particulièrement anxieuse. Bien que les exigences de création de quatre contextes distincts dans ce protocole fonctionnent de manière optimale avec une forme quadrangulaire, une arène circulaire peut également être rendue fonctionnelle après quelques ajustements.
Deuxièmement, les intervalles entre chaque session d’encodage/test doivent être déterminés de manière à ce que les rats conservent le même niveau d’intérêt à chaque fois, tout en évitant le risque d’apprentissage cumulatif résultant d’un calendrier dense de répétitions. Habituellement, un intervalle d’au moins le double de la durée du délai entre l’encodage et les essais est suffisant, des intervalles plus longs étant plus favorables pour plus de deux répétitions. Cela signifie que, bien qu’un intervalle minimum de 48 heures après un test de 24 heures soit suffisant pour une ou deux répétitions, l’utilisation d’un intervalle de 1 semaine est recommandée pour quatre répétitions. Comme le montrent les résultats de la figure 5 et la comparaison à l’aide de l’ANOVA, la tâche peut être répétée avec succès quatre fois. Sur cette base, le protocole établi peut être utilisé pour contrebalancer jusqu’à quatre conditions expérimentales. Le nombre de groupes expérimentaux détermine le nombre de répétitions de sessions d’encodage/d’essai dans des contextes distincts. Les résultats de la figure 5 représentent une façon possible d’utiliser le protocole avec deux groupes expérimentaux. Les groupes ont été contrebalancés en deux sessions, et les mêmes conditions ont été répétées en deux sessions supplémentaires (à des fins de validation). La deuxième série de sessions contrebalancées pourrait également être utilisée pour contrebalancer les nouvelles conditions. De même, trois ou quatre conditions expérimentales peuvent être comparées à l’aide de trois ou quatre séances contrebalancées, respectivement.
Dans ces cas, les contextes doivent être conçus pour tenir compte des caractéristiques contrastées décrites dans le protocole. Il convient de noter que la conception contrebalancée peut ne pas convenir aux expériences dans lesquelles des manipulations supplémentaires, telles qu’une intervention pharmacologique qui pourrait laisser un effet ou des dommages durables, doivent être utilisées. Pour maintenir l’efficacité et la reproductibilité des essais, l’expérience doit être conçue en conséquence. Les données des tests répétés peuvent être présentées et analysées de plusieurs manières, comme le montre la figure 5. Pour une analyse initiale, les groupes expérimentaux dans chaque contexte peuvent être comparés individuellement au niveau de hasard à l’aide d’un test tà un échantillon pour déterminer toute préférence significative(Figure 5B,D). Cela peut être utile pour obtenir une compréhension rapide des données, mais cela ne garantit qu’une comparaison indirecte des groupes. Ainsi, pour comparer deux groupes ou plus, les données doivent être analysées à l’aide de tests tà deux échantillons (appariés ou non appariés) ou d’ANOVA, respectivement. Cela peut se faire sous la forme d’une comparaison entre les sujets des groupes au cours d’une seule session de codage/test(Figure 4A et Figure 5B,D)ou d’une comparaison à l’intérieur du sujet des groupes de deux (ou plusieurs) contextes contrebalancés(Figure 5C,E). Cette dernière méthode est fortement recommandée, en particulier lorsqu’il s’agit de conditions de mémoire faibles, ce qui, comme expliqué précédemment, entraîne une variance élevée en raison du comportement aléatoire.
La combinaison des contextes contrebalancés conduit à des groupes plus importants qui sont nécessaires pour visualiser de manière fiable le comportement du groupe avec une variation minimale. En utilisant un protocole avec des répétitions dans des sessions contrebalancées, on peut s’attendre à une diminution du nombre de rats à environ un tiers du nombre qui serait nécessaire en utilisant un seul test avec la même puissance statistique. Habituellement, la taille des échantillons dans une plage de 7 à 15 rats (total) pour les séances contrebalancées et dans une gamme de 20 à 50 rats (10 à 25 par groupe) pour une seule session avec une taille d’effet et une puissance supérieures à 0,8 sont suffisantes. La diminution du nombre d’animaux nécessaires et l’augmentation de l’information que nous obtenons de chaque animal utilisant ce protocole affinent l’étude et servent les principes 3R d’utilisations éthiques des animaux dans la recherche. Il est important à cette étape de garder à l’esprit que le comportement aléatoire du rat, qui n’est pas accompagné d’une forte mémoire, peut entraîner des préférences individuelles fortes à la fois inférieures et supérieures au hasard, mais la moyenne du groupe devrait donner une préférence qui n’est pas significativement différente du hasard. Les données individuelles doivent être interprétées avec prudence. La distribution des points de données individuels au sein d’un groupe peut également être informative pour interpréter les résultats. Comme le illustrent les figures 4 et 5,la distribution change en fonction de la force de la mémoire. Dans l’ensemble, le protocole présenté ici peut être suivi facilement pour implémenter la tâche de localisation de l’objet avec des répétitions pour modéliser la mémoire spatiale à court terme et / ou à long terme. Le protocole de formation simple et flexible et la possibilité de mettre en œuvre d’autres manipulations font de cette tâche un choix populaire. Ces modifications apportées au protocole permettent d’enquêter sur des étapes particulières telles que l’acquisition, la consolidation et le rappel de la mémoire.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier Antonios Asiminas, Dorothy Tse, Kiichi O’Hara et David Bett pour leurs commentaires et suggestions perspicaces. Cette étude a été soutenue par Erasmus+ (à G.B. et L.N.); la Graduate School of Health, Université d’Aarhus (à K.H.); Novo Nordisk Foundation Young Investigator Award 2017 (NNF17OC0026774), Lundbeckfonden (DANDRITE-R248-2016-2518) et PROMEMO – Center for Proteins in Memory, un centre d’excellence financé par la Fondation nationale danoise de la recherche (DNRF133) (à T.T.).
Open-field/experimental box | O'Hara & Co (Japan) | OF-3001 | Open-field box for the object location task |
Object 1: cones | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RR | |
Object 2: footballs | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RB | |
Object 3: rectangular blocks | O'Hara & Co (Japan) | ORO-RC | Rectangular blocks were modified after purchase |
Object location task apparatus | O'Hara & Co (Japan) | SPP-4501 | Sound attenuating box that contains the open-field box for the object location task |
Tracking software | O'Hara & Co (Japan) | TimeSSI | For movement tracking and automated camera functions |
Wild-type Lister Hooded rats | Charles River | 603 |