Uso della coltura di organi di tipo Trowell per studiare la regolazione delle cellule staminali dentali

Summary

Il metodo di coltura degli organi di tipo Trowell è stato utilizzato per svelare complesse reti di segnalazione che governano lo sviluppo dei denti e, più recentemente, per studiare la regolazione coinvolta nelle cellule staminali dell’incisivo di topo in continua crescita. I modelli animali fluorescenti e i metodi di imaging dal vivo facilitano analisi approfondite delle cellule staminali dentali e del loro specifico microambiente di nicchia.

Abstract

Lo sviluppo, la funzione e la rigenerazione degli organi dipendono dalle cellule staminali, che risiedono all’interno di spazi anatomici discreti chiamati nicchie di cellule staminali. L’incisivo di topo in continua crescita fornisce un modello eccellente per studiare le cellule staminali tessuto-specifiche. Le cellule staminali epiteliali tessuto-specifiche dell’incisivo si trovano all’estremità prossimale del dente in una nicchia chiamata ansa cervicale. Forniscono un afflusso continuo di cellule per controbilanciare la costante abrasione della punta autoaffilante del dente. Presentato qui è un protocollo dettagliato per l’isolamento e la coltura dell’estremità prossimale dell’incisivo del topo che ospita le cellule staminali e la loro nicchia. Si tratta di un protocollo di coltura di organi di tipo Trowell modificato che consente la coltura in vitro di pezzi di tessuto (espianti), nonché le fette di tessuto spesso all’interfaccia liquido / aria su un filtro supportato da una griglia metallica. Il protocollo di coltura degli organi qui descritto consente manipolazioni tissutali non fattibili in vivo e, se combinato con l’uso di uno o più reporter fluorescenti, fornisce una piattaforma per l’identificazione e il monitoraggio di popolazioni cellulari discrete nei tessuti vivi nel tempo, comprese le cellule staminali. Varie molecole regolatorie e composti farmacologici possono essere testati in questo sistema per il loro effetto sulle cellule staminali e le loro nicchie. Questo in definitiva fornisce uno strumento prezioso per studiare la regolazione e il mantenimento delle cellule staminali.

Introduction

Gli incisivi di topo crescono continuamente grazie alla conservazione permanente delle cellule staminali (SC) che supportano la produzione incessante di componenti dentali. Questi includono SC epiteliali, che generano ameloblasti che producono smalto, e cellule staminali mesenchimali (MSC), che generano odontoblasti che producono dentina, tra le altre cellule¹. Le SC epiteliali negli incisivi a crescita continua sono state inizialmente identificate^{come cellule 2,3} che mantengono l’etichetta e da allora hanno dimostrato di esprimere un certo numero di geni staminali ben noti^, tra cui Sox2⁴. Queste cellule condividono caratteristiche comuni con SC epiteliali in altri organi e risiedono all’interno della nicchia SC chiamata ansa cervicale situata sul lato labiale dell’incisivo. La nicchia è un’entità dinamica composta da cellule e matrice extracellulare che controllano l’attività SC⁵. Studi di lineage tracing hanno dimostrato che le SC epiteliali Sox2+ possono rigenerare l’intero compartimento epiteliale del dente e che sono cruciali per la formazione dei denti di successione ^6,7. Le MSC con potenziale riparativo o rigenerativo della dentina sono in gran parte reclutate dall’esterno dell’organo attraverso i vasi sanguigni e i nervi 8,9,10,11^, fornendo quindi un modello adatto per studiare il reclutamento, la migrazione e l’alloggiamento della popolazione MSC.

Studiare le SC in vivo non è sempre fattibile, poiché molte delle manipolazioni genetiche e/o farmacologiche possono influenzare l’omeostasi degli organi e/o avere conseguenze letali. Pertanto, la coltura di organi fornisce uno strumento eccellente per studiare la regolazione delle SC e delle loro nicchie in vitro. Il sistema di coltura degli organi che utilizza una griglia metallica è stato inizialmente sviluppato da Trowell¹² per studiare lo sviluppo degli organi ed è stato ulteriormente modificato da Saxen¹³ per studiare i segnali induttivi nello sviluppo renale. Da allora, questo metodo in vitro di coltura dell’intero organo o parte di esso è stato applicato con successo de diversi campi. Nel campo dello sviluppo dei denti, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare le interazioni epiteliali-mesenchimali che governano lo sviluppo dei denti¹⁴ e la formazione dei denti di successione¹⁵. Il lavoro del laboratorio Thesleff ha dimostrato l’utilità di questo sistema per l’analisi temporale della crescita e della morfogenesi dei denti, per l’analisi dell’effetto di varie molecole e fattori di crescita sulla crescita dei denti e per l’imaging live time-lapse dello sviluppo dei denti^16,17. Più recentemente, questo metodo è stato utilizzato per studiare la regolazione degli incisivi SC e la loro nicchia^18,19, che è descritta in dettaglio qui.

Protocol

Questo protocollo prevede l’uso di animali e tutte le procedure sono state approvate dai comitati etici per l’uso e la cura degli animali e dalla struttura per animali dell’Università di Helsinki. 1. Preparazione del piatto di coltura dell’organo Eseguire tutte le procedure in una cappa a flusso laminare. Pulire le superfici di lavoro con etanolo al 70% e utilizzare strumenti e soluzioni in vetro autoclavato. Sterilizzare le forbici e altre attrezzature metalliche in uno sterilizzat…

Representative Results

Le SC epiteliali risiedono in una nicchia chiamata ansa cervicale, che si trova all’estremità prossimale dell’incisivo (Figura 3A). Le anse cervicali sono strutture morfologicamente distinte composte da epitelio smaltato interno ed esterno che racchiudono il reticolo stellato, un nucleo di cellule epiteliali disposte liberamente (Figura 3B,C). Ci sono due anse cervicali in ogni incisivo (Figura 3A), ma solo l’ansa …

Discussion

La coltura d’organo in vitro è stata ampiamente utilizzata per studiare il potenziale induttivo e le interazioni epiteliali-mesenchimali che governano la crescita e la morfogenesi degli organi. Il laboratorio Thesleff ha dimostrato come adattare la modifica di Saxén della coltura di organi di tipo Trowell e usarla per studiare lo sviluppo dei denti¹⁴. Le condizioni riproducibili e i progressi nei reporter fluorescenti hanno reso questo un metodo utile per monitorare la morfogenesi dei d…

Materials

1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Extra Fine Bonn Scissors	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS South American (CE)	LifeTechn.	10270106	divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter	MerckMillipore	VCTP02500	Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid	Sigma	A4544-25g	diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose	TopVision	R0801
Metal grids			Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps	Medicon	07.60.03
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass	DWK Life Sciences	9170442
Petridish 35 mm, with vent	Duran	237554008
Petridish 90 mm, no vent classic	Thermo Fisher	101RT/C
Small scissors