Denne protokol beskriver en ikke-invasiv metode til effektivt at identificere S-fase celler til downstream mikroskopi undersøgelser, såsom måling AF DNA reparation protein rekruttering ved laser mikro-bestråling.
DNA-skade reparation opretholder den genetiske integritet af celler i et meget reaktivt miljø. Celler kan akkumulere forskellige typer af DNA-skader på grund af både endogene og udefrakommende kilder såsom metaboliske aktiviteter eller UV-stråling. Uden DNA-reparation bliver cellens genetiske kode kompromitteret, underminerer proteiners strukturer og funktioner og forårsager potentielt sygdom.
Forståelse af de forskellige DNA-reparationsvejes spatiotemporale dynamik i forskellige cellecyklusfaser er afgørende inden for dna-skadesreparation. Nuværende fluorescerende mikroskopi teknikker giver gode værktøjer til at måle rekruttering kinetik af forskellige reparation proteiner efter DNA-skader induktion. DNA-syntese i cellecyklussens S-fase er et ejendommeligt punkt i celle skæbne med hensyn til DNA-reparation. Det giver et unikt vindue til at screene hele genomet for fejl. Samtidig udgør DNA-syntesefejl også en trussel mod DNA-integriteten, som ikke opstår i ikke-dividerende celler. Derfor adskiller DNA-reparationsprocesser sig betydeligt i S-fasen sammenlignet med andre faser af cellecyklussen, og disse forskelle er dårligt forstået.
Følgende protokol beskriver forberedelsen af cellelinjer og måling af dynamikken i DNA-reparation proteiner i S fase på lokalt induceret DNA-skader steder, ved hjælp af en laser-scanning konfokal mikroskop udstyret med en 405 nm laser linje. Tagged PCNA (med mPlum) bruges som cellecyklusmarkør kombineret med et AcGFP-mærket reparationsprotein af interesse (dvs. EXO1b) til at måle rekrutteringen af DNA-skader i S-fasen.
Flere DNA-reparationsveje har udviklet sig til at adressere de forskellige typer DNA-læsioner, der kan opstå i celler, som alle er stærkt reguleret i både rum og tid. En af de mest sårbare perioder i cellecyklussen er S-fase, når DNA-syntese opstår. Selv om spredning er grundlæggende for livet, er det også en stor udfordring. Celler skal sikre trofast replikation af deres genom for at undgå mutationer, der skal videregives til fremtidige generationer. Derfor er spredning et terapeutisk interventionspunkt, der er blevet anvendt til udvikling af terapeutiske tilgange inden for onkologi.
Alle de vigtigste teknikker, der anvendes til at studere protein rekruttering på DNA-læsioner har deres styrker og begrænsninger. Mikrobestråling har bedre rumlig og tidsmæssig opløsning1 end de fleste af de alternative metoder som immunfluorescent billeddannelse af imiterende strålingsfremkaldt foci (IRIF), kromatin-immunprecipitation (ChIP) eller biokemisk fraktionering. Mikrobestrålingen giver imidlertid robustheden af de ovennævnte teknikker, der kan prøve et stort antal celler på samme tid.
For at undersøge DNA-reparation i S-fase skal man kunne skelne S-faseceller i en asynkron cellekulturpopulation. Der er mange velkendte metoder til at løse dette, der involverer enten synkronisering af celler eller visualisering af de forskellige cellecyklusfaser. Begge tilgange giver dog betydelige udfordringer og mulige genstande. Kemiske synkroniseringsmetoder, der i vid udstrækning anvendes til at berige celler i den tidlige S-fase (f.eks. dobbelt thymidinblok, bladlusicolin og hydroxyurea-behandling) opnår synkronisering gennem induktion af replikationsstress og i sidste ende DNA-skader i sig selv. Dette begrænser brugen af disse metoder til at studere DNA-reparationsprocesser i S fase2. Synkronisering gennem serum sult og frigivelse gælder kun for et begrænset antal cellelinjer, stort set eksklusive kræft cellelinjer, der er mindre afhængige af vækstfaktorer for celle-cyklus progression i forhold til ikke-transformerede cellelinjer. Fluorescens Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) systemet er et særligt nyttigt værktøj til at studere cellecyklussen, men det har en grundlæggende begrænsning, når der skelnes mellem S- og G2-cellecyklusfaser3.
Her er det vist, at ved hjælp af fluorescerende mærkede PCNA som en ikke-invasiv markør for S fase begrænser ulemperne ved kemiske celle-cyklus synkroniseringsmetoder, samtidig med at der er mulighed for mere specificitet og fleksibilitet end FUCCI-systemet. Som en enkelt markør kan PCNA ikke kun fremhæve S-faseceller i en asynkron population, men det kan også vise den nøjagtige progression af celler inden for S-fase (dvs. tidlig, midt eller sen S-fase)4. Lave ekspressionsniveauer af eksogent, mærket PCNA sikrer minimal interferens med både cellecyklus progression og DNA-reparationsprocesser. Det er vigtigt, at PCNA også fungerer som en intern kontrol for korrekt induktion af DNA-skader, da det er involveret i reparation af flere DNA-læsioner og rekrutteres til lokalt inducerede DNA-skadessteder1,4.
De eksperimenter, der præsenteres her, viser, hvordan man måler rekrutteringsdynamikken i EXO1b i S-fasen, og hvordan dette påvirkes af den veletablerede PARP-hæmmer, olaparib. EXO1b nucleaseaktivitet er relevant for en lang række DNA-reparationsveje, herunder reparation af mismatch (MMR), nukleotid excision repair (NER) og dobbeltstrenget pause (DSB) reparation. I S-fasen spiller EXO1b en stor rolle i homolog rekombination (HR) gennem dannelsen af 3′ sDNA-udhæng under DNA-resektion5. EXO1b har været yderligere impliceret i DNA-replikation med roller i checkpoint aktivering for at genstarte gået i stå DNA gafler samt primer fjernelse og Okazaki fragment modning på halter streng under streng forskydning i replikation5. EXO1b-rekruttering til beskadigede DNA-steder reguleres af den direkte interaktion med poly (ADP-ribose) (PAR)6,7. På grund af de mange cellecyklusspecifikke konsekvenser af EXO1b er det et glimrende valg for S-fase specifikke rekrutteringsstudier ved hjælp af PCNA.
Kritiske trin og potentiel fejlfinding/-ændringer af protokoller
Korrekt vævskulturbeholder til mikrobestråling er afgørende for succes. De fleste billedsystemer med høj opløsning er optimeret til 0,17 mm dækglastykkelse. Brug af højere eller lavere tykkelse billeddannelse kamre eller dem fremstillet af plast polymerer (ikke optimeret til 405 nm billeddannelse), kan reducere billedkvaliteten betydeligt. Når du bruger glasoverflader, skal du sørge for, at de er vævskulturbehandlet for at forbedre celle vedhæftning. Hvis de ikke er vævskulturbehandlet, skal disse kamre f.eks. Ved plating af celler i det chambered coverglass er ideel celletæthed altafgørende for at undgå uregelmæssigheder i cellecyklussen og yderligere stress til cellerne. Korrekt termisk ekvilibrering af mikroskopkomponenterne før forsøg for at opretholde en stabil temperatur er afgørende for både at opretholde fokus gennem hele tiden bortfalder billeddannelse og er også nødvendig for at sikre en homogen DDR på tværs af tid og prøver.
Det er afgørende, at cellerne er i en sund tilstand forud for mikrobestråling for at reducere artefaktiske data. Hvis celler har uregelmæssig morfologi efter infektion/udvælgelse, skal cellerne udvikle sig gennem flere passager, indtil morfologien vender tilbage til normal. Sørg altid for, at de anvendte cellelinjer er fri for mycoplasmaforurening. Blandt de mange bivirkninger af mycoplasma infektion, det forårsager også DNA-skader på værtscellerne og kan påvirke deres DDR veje14,15. Den mest følsomme måde at opdage mycoplasma i cellekulturen er gennem PCR (versus detektion med DAPI eller Hoechst).
Optimal overekspression af reparationsproteinet af interesse bør kunne sammenlignes med endogene niveauer, men høje nok til påvisning. Promotoren, der anvendes på de virale vektorer, den virale titer under infektion, og længden af infektionen tid kan alle justeres for ideelle udtryk niveauer. For at opnå ensartede resultater skal du isolere individuelle cellekloner for at sikre homogene udtryksniveauer og normal cellemorfologi. Det anbefales at bruge vektorkonstruktioner, der ikke overekspresserer mærket PCNA på højere end endogene niveauer for korrekt cellecyklus og DNA-reparationsmarkørfunktion. Selv lave niveauer af PCNA overekspression er tilstrækkelige til at diskriminere S-fase celler. Retroviral pBABE vektorer er blevet anvendt med succes til dette formål (Addgene # 1764, # 1765, # 1766, # 1767). PCNA kan mærkes med monomerisk rød(f.eks mPlum, mCherry, mRuby, etc.) eller monomeriske grønne fluorescerende proteiner (f.eks mEGFP, AcGFP, mWasabi, mNeonGreen, mEmerald osv.), som derefter kunne kombineres med en skiftevis mærket POI. Overekspressering af et fluorescerende mærket POI har nogle begrænsninger og overvejelser. Fluorescerende tags kan forstyrre normal proteinfunktion og lokalisering. Således skal placeringen af mærket (N eller C-terminal) overvejes. Brug altid monomeriske fluorescerende proteiner, da oligomerisering af ikke-monomeriske varianter kan påvirke POI’ens funktion.
Laserindstillingerne skal bestemmes for hvert billedsystem, da mange komponenter i den optiske sti vil påvirke den faktiske effekt, der leveres i cellerne. Laser mikro-bestråling kan forårsage flere typer af DNA-læsioner afhængigt af excitation bølgelængde, effekt af FRAP laser og hvis nogen præ-sensibiliserende midler (som Bromodeoxyuridin eller Hoechst) blev brugt. 405 nm lasere kan forårsage oxidativ DNA-skade, enkelt og dobbelt strandede pauser16,17. Ved at bruge højere indstillinger for laserudgang øges mængden af DSBs. I denne protokol pre-sensibilisering metoder blev ikke udnyttet, men disse teknikker er i høj grad dækket i litteraturen og re-capped i diskussionen nedenfor. Efter vores mening er den bedste måde at teste, om den ønskede læsion genereres ved at teste for rekruttering af kendte DNA-skader vej specifikke gener. Rekruttering af NTHL1 eller OGG1, komponenter i BER-stien, tyder på induktion af oxiderede DNA-baser10,11,17,18,19, mens FBXL10 eller XRCC5 angiver tilstedeværelsen af DSBs8,20,21. Rekruttering af XRCC1 kan indikere både tilstedeværelsen af oxiderede DNA-baser og enkelte strandede pauser (SSB)22,23. XPC (dvs. RAD4) er en god indikator for NER, der fjerner de voluminøse DNA-adducts genereret af ultraviolet lys (UV)17,24. Fordi rekruttering af udefrakommende proteiner kan indføre visse uregelmæssigheder, kan immunofluorescent farvning af endogene DNA-reparationsproteiner eller markører (som γH2A.X for dobbeltstrengede pauser) bekræfte tilstedeværelsen af specifikke DNA-læsioner. Alternativt kan antistoffer rejst mod specifikke typer dna-læsioner også anvendes. For at justere den leverede lasereffekt kan både opholdstiden og lasereffekten ændres.
Ved hjælp af matematisk modellering kunne der udføres en detaljeret kinetisk analyse, der kan give værdifuld indsigt i POI’s rekrutteringsegenskaber (f.eks. bidrag fra flere DNA-bindende domæner, følsomhed over for forskellige signalhændelser osv.). Automatiseret rekrutteringsevaluering og cellesporing kan kombineres for at skabe robuste arbejdsgange 1,25.
Fordele og begrænsninger ved DNA pre-sensibilisering
Præfølsomhed af DNA før mikrobestråling er et almindeligt anvendt værktøj til rekruttering af DNA-reparation af protein16,17. Sensibiliserende DNA før mikrobestråling gør det mere modtageligt for DSBs. De to mest almindelige metoder til DNA-præfølsomhed er forbehandling af celler med enten Bromodeoxyuridin (BrdU) eller Hoechst farvestof. For systemer, der ikke er i stand til mikrobestråling ved høje laserkræfter, kan disse metoder være nødvendige for at fremkalde DNA-læsioner som DSBs. Derudover fungerer Hoechst som både et præfølsomt signal, der fremhæver cellekernen (f.eks. når man studerer rekrutteringen af ukodede endogene DNA-reparationsproteiner), som både et præfølsomt værktøj og en fluorescerende atomplet. Dna pre-sensibilisering kan dog introducere betydelige komplikationer. BrdU (anvendes ved en endelig koncentration på 10 μM) skal tilsættes cellerne 24 timer (eller tid svarende til en fuld cellecyklus i den anvendte cellelinje) for korrekt at indarbejde i DNA og kan forårsage cellecyklusinterferens26. Hoechst 33342 (anvendes i en endelig koncentration på 1 μg/mL) er cytotoksisk efter lange inkubationsperioder, men kræver tilstrækkelig tid til at mætte kernen med farvestoffet. Derfor bør det kun anvendes 15-20 minutter før mikrobestråling; Ellers vil rekrutteringsdataene ikke være konsistente. Cellerne farves på denne måde kan ikke holdes i kultur i mere end et par timer27,28. Sørg for ikke at bruge Hoechst 33358, som ikke er så celle permeable som Hoechst 33342 farvestof. Præsensibilisering kan også indføre unødvendig varians blandt eksperimenter og gør eksperimentet endnu mere følsomt over for forskelle i celletæthed (da dette vil påvirke mængden af indarbejdet farvestof / celle).
Fordele og begrænsninger ved konfokal mikroskopi
Billedhastighed af konfokal mikroskopi kan være begrænsende i forhold til widefield mikrokopi. Men et konfokalt mikroskop udstyret med en resonant scanner kan enormt forbedre billedhastigheden (på bekostning af opløsning) kommer tæt på hastigheder på spinning-disk mikroskopi. Tre funktioner gør A1R HD25 confocal-systemet til et glimrende valg til den protokol, der præsenteres her. For det første gør systemets 25 mm FOV det muligt at afbilde mellem 15-20 celler i et enkelt scannet felt (vs. 5-10 celler i regelmæssige opsætninger), hvilket begrænser antallet af erhvervelser, der er nødvendige for at få nok celler til statistisk analyse. For det andet gør FRAP-modulet og to scanheads det muligt at afbilde og mikroforbedre cellerne samtidigt, ikke kun sekventielt. Endelig giver fleksibiliteten ved at have både resonant og galvano scannere mulighed for nemt at skifte mellem høj tidsmæssig opløsning billeddannelse med enestående hastighed, som minimerer slukning af fluorophores, og høj-rumlig opløsning billeddannelse, der udnytter langsommere scanningshastigheder til at producere billeder med et højere signal til støj ratio. Mens det anvendte system gjorde det muligt for ovennævnte fleksibilitet, at ligne mere bredt tilgængelige konfokale mikroskop konfigurationer, kun galvano scanneren blev brugt i de præsenterede eksperimenter (for både mikro-bestråling og efterfølgende billeddannelse).
Fordele og begrænsninger ved mikrobestråling
Mens mikrobestråling giver uovertruffen rumlig og tidsmæssig opløsning, er det ikke uden begrænsninger. DNA-skader ved laser mikro-bestråling er stærkt grupperet til bestemte dele af kernen i forhold til naturligt forekommende skadelige stoffer. Kromatinrespons på grund af mikrobestråling kan således variere i forhold til homogent fordelt skade. Derudover er mikrobestråling tidskrævende og kan kun udføres på et par dusin celler, mens store befolkningsbaserede biokemiske metoder (kromatinfraktionering, immunprecipitation, ChIP) kan give øget robusthed ved at studere tusindvis af celler ad gangen. Kontrol af observationer foretaget af mikrobestråling med traditionelle biokemiske teknikker er en effektiv strategi for pålidelige konklusioner. Selvom samtidig mikrobestråling af mange celler i en bestemt FOV er mulig, vil billedsystemet have brug for mere tid til at udføre opgaven. Derfor begrænser målingen af dynamikken i proteiner, der rekrutterer meget hurtigt til DNA-læsioner, antallet af mulige ROI’er for mikrobestråling, der anvendes samtidigt. På det billedsystem, der anvendes til denne protokol, tager mikrobestrålingen af et enkelt 1024 pixel langt ROI 1032 ms ved hjælp af 1000 μs opholdstid og 3088 ms ved hjælp af 3000 μs dvæle tid til at fuldføre. Brug af flere linjer af ROI vil øge den tid, der er nødvendig for at afslutte mikrobestråling (f.eks 7 x 1024 pixel lang ROI tager 14402 ms ved hjælp af 1000 μs dwell tid og 21598 ms ved hjælp af 3000 μs opholdstid). Denne gang er tabt fra billederhvervelse og skal tages i betragtning. Når du billeddannelse hurtige rekruttering begivenheder, bruge den kortest ROI muligt og kun mikro-bestråle en celle ad gangen.
Fordele og begrænsninger i forhold til synkroniseringsmetoder
I forbindelse med cellecyklusspecifikke undersøgelser omfatter de eksisterende metoder enten synkronisering af celler i specifikke cellecyklusfaser eller ved hjælp af fluorescerende reportere til at identificere cellens specifikke cellecyklusfase. Men hver af disse metoder giver deres egne udfordringer og begrænsninger.
FUCCI system3 (afhængig af fluorescerende protein mærkede afkortede former for CDT1 og Geminin) er et særligt nyttigt værktøj til celle cyklus undersøgelser, men har begrænsninger, når det kommer til at skelne mellem S og G2 faser af celle cyklus. Geminin niveauer er allerede høje fra midten af S fase og forblive høj indtil M fase, hvilket gør disse faser vanskeligt at adskille. Brug af FUCCI-systemet betyder også, at to optiske kanaler i mikroskopet ikke kan bruges til billeddannelse af POI.
Ikke-kræft cellelinjer kunne synkroniseres i G0 ved fjernelse af vækstfaktorer findes i serum (serum sult) forårsager ringe eller ingen DNA-skader på cellerne. Men, de fleste kræft cellelinjer vil delvist fortsætte med at udvikle sig gennem celle cyklus selv uden tilstrækkelige mængder af serum i deres medier. Derudover begynder cellerne delvist at miste synkroniseringen i den sene G1-fase, tidlige S-fase. Ud over serum sult, der er mange kemiske metoder til at opnå celle cyklus synkronisering. Hydroxyurea, bladlusicolin og thymidinblokke er metoder til at stoppe DNA-replikation for at synkronisere celler i den tidlige S-fase. Mens disse metoder er billige og enkle, introducerer de replikationsstress, hvilket resulterer i DNA-skade. Disse DNA-replikationshæmmere har vist sig at fremkalde fosforylering af H2A. X, en velkendt markør for DSBs2,29. Metoden til at bruge tagged-PCNA som en markør for S-fase celler reducerer potentialet for artefakter forårsaget af kemisk synkronisering og kan anvendes på en bred vifte af cellelinjer i forhold til serum sult.
Konklusion
DNA-skader er en drivkraft for genetiske sygdomme, hvor mutagene læsioner kan føre til ondartet transformation af celler. Målretning af DNA syntese maskiner er en grundlæggende terapeutisk strategi til behandling af hyperproliferative sygdomme som kræft. For at behandle disse sygdomme på en mere målrettet måde har vi brug for en bedre forståelse af de proteiner, der reparerer DNA-læsioner. Den protokol, der er beskrevet her, hjælper mikrobestrålingsbaserede undersøgelser i S-fasen ved at minimere de udfordringer, der præsenteres af traditionelle synkroniseringsmetoder for at reducere mulige genstande og øge reproducerbarheden af forsøgene.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker M. Pagano for hans fortsatte støtte samt D. Simoneschi, A. Marzio og G. Tang for deres kritiske gennemgang af manuskriptet. B. Miwatani-Minter takker R. Miwatani og B. Minter for deres fortsatte støtte. G. Rona takker K. Ronane Jurasz og G. Rona for deres fortsatte støtte.
Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434-500G | For quenching formaldehyde |
Anti-EXO1 Rabbit Polyclonal Antibody | Proteintech | 16253-1-AP | primary antibody |
Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301 | Millipore | 05-636 | primary antibody |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | 3117332001 | BSA for blocking |
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine) | Merck | 19-160 | pre-sensitizing agent |
Citifluor™ Mountant Solution AFR3 | Electron Microscopy Sciences | 17973-10 | antifade containing PBS solution for imaging |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | nucleic acid stain |
DMEM Medium | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | Cell culture medium for HEK293T cells |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | Vehichle control and dissolution solvent |
EGFP-FBXL10 | Addgene | #126542 | viral expression vector for EGFP-FBXL10 |
EXO1b-AcGFP (in pRetroQ) | custom cloning | na | EXO1b cDNA was cloned in the NheI, BamHI sites of pRetroQ-AcGFP1-N1 vector. |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140071 | Media supplement |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1896701 | Phenol red free medium for microscopy |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Thermo Fisher Scientific | A32723 | secondary antibody |
HEK293T cells | ATCC | ATCC CRL-3216 | Cell line for viral packaging |
HEPES | Sigma-Aldrich | H0887-100ML | Buffering agent to supplement live cell imaging medium |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | pre-sensitizing agent |
Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000015 | Transfection reagent |
McCoy’s 5A (Modified) Medium | Life Technologies | 16600-108 | Cell culture medium for U-2 OS cells |
mCherry-PCNA | Addgene | #55117 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA | Addgene | #55994 | non-viral PCNA construct suitable for cell cycle marker |
mPlum-PCNA (in pBABE) | custom cloning | na | mPlum-PCNA cDNA was cloned from Addgene #55994 in the BamHI, SalI sites of pBABE (puro) |
Nikon A1R-HD25 Confocal Scanhead and Controller | Nikon | na | confocal imaging system |
Nikon LUN4 laser unit | Nikon | na | excitation system |
Nikon LUN-F 50 mW 405 nm FRAP laser unit | Nikon | na | FRAP laser unit |
Nikon NIS Elements Confocal Controller Software | Nikon | na | Confocal controlling software |
Nikon Ti2-E Inverted Microscope | Nikon | na | inverted epifluorescent microscope base |
Nikon Ti2-LAPP Modular Illumination System | Nikon | na | illumination system |
NTHL1-mCherry (in pRetroQ) | custom cloning | na | NTHL1 cDNA was cloned in the NheI, SalI sites of pRetroQ-mCherry-N1 vector. |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (4 well) | Thermo Fisher Scientific | 155382PK | Live cell microscopy cell culture chamber |
Olaparib | Selleck Chemicals | S1060 | PARP inhibitor |
Opti-MEM reduced serum media | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Dilution medium for transient transfection |
Paraformaldehyde aqueous solution (32%) | Thermo Fisher Scientific | 50-980-494 | Fixative |
pBABE (hygro) | Addgene | #1765 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (neo) | Addgene | #1767 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (puro) | Addgene | #1764 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
pBABE (zeo) | Addgene | #1766 | retroviral expression vector (for low expression levels) |
PCNA Antibody (PC10) | Santa Cruz | sc-56 | primary antibody |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Gibco | 10378016 | Media supplement |
polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003 | Increase viral infection efficiency |
pRetroQ-AcGFP-C1 | Takara | 632506 | retroviral expression vector |
pRetroQ-AcGFP-N1 | Takara | 632505 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-C1 | Takara | 632567 | retroviral expression vector |
pRetroQ-mCherry-N1 | Takara | 632568 | retroviral expression vector |
pUMVC | Addgene | #8449 | Viral packaging vector |
Sodium-pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | Supplement for live cell imaging medium |
Triton X-100 aqueous solution (10%) | Sigma-Aldrich | 11332481001 | Dilute in PBS for cell permeabilization buffer |
Trypsin-EDTA Solution 10X | Sigma-Aldrich | 59418C-100ML | Dilute in PBS to split cells |
U-2 OS Cells | ATCC | HTB-96 | Optimal cell line for microscopy experiments |
Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | PCR based Mycoplasma detection kit |
VSV-G | Addgene | #8454 | Viral protein envelope vector |