Vi demonstrerer en metode til at isolere svært at dyrke medlemmer af romanen bakteriel phylum, Saccharibacteria, ved at filtrere plak og co-dyrkning med vært bakterier.
Mange bakteriearter kan ikke dyrkes i laboratoriet ved hjælp af standardmetoder, hvilket udgør en betydelig barriere for at studere størstedelen af den mikrobielle mangfoldighed på jorden. Nye tilgange er nødvendige for at dyrke disse ikke-dyrkede bakterier, så efterforskerne effektivt kan studere deres fysiologi og livsstil ved hjælp af de kraftfulde værktøjer, der er tilgængelige i laboratoriet. Kandidaten Phyla Radiation (CPR) er en af de største grupper af udyrkede bakterier, der omfatter ~ 15% af den levende mangfoldighed på jorden. Det første isoleret i denne gruppe var medlem af Saccharibacteria phylum, ‘Nanosynbacter lyticus‘ stamme TM7x. TM7x er en usædvanlig lille bakterie, der lever som en symbiont i direkte kontakt med en bakterievært, Schaalia odontolytica, stamme XH001. Ved at drage fordel af den usædvanligt lille cellestørrelse og dens livsstil som en symbiotisk organisme udviklede vi en protokol til hurtigt at dyrke Saccharibacteria fra plak. Denne protokol vil vise, hvordan man filtrerer en suspension af plak gennem et 0,2 μm filter, og koncentrerer derefter de indsamlede Saccharibacteria-celler og inficerer en kultur af værtsorganismer. Den resulterende coculture kan passeres som enhver normal bakteriel kultur og infektion er bekræftet af PCR. Den resulterende binære kultur kan opretholdes i laboratoriet og bruges til fremtidige eksperimenter. Mens forurening er en mulighed, kan den binære kultur renses ved enten yderligere filtrering og geninfektion af vært, eller ved plating den binære kultur og screening for inficerede kolonier. Vi håber, at denne protokol kan udvides til andre prøvetyper og miljøer, hvilket fører til dyrkning af mange flere arter i CPR.
Dyrkning af nye bakteriearter og bringe dem ind i laboratoriet giver mulighed for kraftfulde eksperimenter for bedre at forstå deres fysiologi og bredere interaktioner inden for deres mikrobielle samfund. Mens der er kulturfri metoder til at afhøre disse spørgsmål (f.eks. “meta-omics”), gør de komplekse interaktioner mellem forskellige mikrobielle populationer det vanskeligt at drille enkelte variabler fra hinanden og nå frem til meningsfulde konklusioner. Mens dyrkning af bakterier har mange fordele, er der mange potentielle barrierer for at isolere en bakterie og dyrke den i ren kultur. Potentielle specifikke vækstkrav omfatter pH, iltspænding, vitaminer, vækstfaktorer, signalmolekyler eller endda direkte cellekontakt for at fremkalde vækst1. Det menes dog, at specifikke auxotrophies er den primære afskrækkende virkning på dyrkning af nye arter af bakterier. Standard medier formuleringer mangler mange næringsstoffer, der kræves af udyrkede bakterier, såsom specifikke vitaminer eller kulstof kilder. Disse manglende molekyler kan være nøglen til fysiologien af de ikke-dyrkede bakterier og leveres normalt af enten en anden organisme i det mikrobielle samfund eller en værtsorganisme. For eksempel kan komplekse kulhydrater som muciner leveres af dyreværter. Tilføjelse af disse til medierne har tilladt dyrkning af flere bakterier fra dyreindvolde, herunder Akkermansia muciniphila og Mucinivorans hirudinis2,3,4. Mange patogene bakterier har udviklet evnen til at bruge jern bundet til hemin i dyreceller, herunder det orale patogen Porphyromonas gingivalis5. I laboratoriet kan væksten af Porphyromonas og andre organismer stimuleres ved tilsætning af hemin6.
For nylig er mange gennembrud i dyrkning af nye isolater af bakterier kommet gennem co-dyrkning, ved hjælp af en “feeder” organisme til at give specifikke faktorer til ikke-dyrkede bakterier er nødvendige for deres vækst. En elegant undersøgelse af Vartoukian og kolleger viste, at siderophores, jern bindende molekyler produceret af bakterier, stimuleret væksten af flere nye mundtlige isolater. Pyoverdiner, en type siderophore produceret af pseudomonad arter, blev vist sig at lette væksten af en ny Prevotella art7. I samme undersøgelse blev det første orale islat til phylum Chloroflexi dyrket, også ved hjælp af F. nucleatum som hjælper til at give nogle endnu ukendte forbindelser7. For nylig blev en bakterie fra slægten Ruminococcaceae isoleret ved hjælp af Bacteroides fragilis som hjælperorganisme8. Det blev senere vist, at gamma aminobutyrinsyre (GABA), en hæmmende neurotransmitter, var nødvendig for vækst på laboratoriemedier. Brug af foderorganismer har vist sig at være en nøglestrategi til at efterligne specifikke mikromiljøer, hvor ikke-dyrkede bakterier vokser, idet de er mere effektive end løbende at omformulere vækstmedier med forskellige tilsætningsstoffer i forskellige koncentrationer.
En af de største grupper af ikke-dyrkede bakterier er i “Candidate Phyla Radiation” (CPR), en monofyletisk gruppe af flere kandidatbakterielle phyla9,10. Fra dette skrives, kun medlemmer af Saccharibacteria phylum inden for CPR er blevet med succes dyrket i laboratoriet. Den første isolere, ‘Nanosynbacter lyticus ‘stamme TM7x, blev isoleret ved hjælp af antibiotika streptomycin, som var blevet forudsagt at berige for den ikke-dyrkede TM711,12. En vigtig opdagelse af dette arbejde var, at det nye isolat voksede som en parasit, der voksede i direkte kontakt med en bakteriel vært, Schaalia odontolytica, og mikroskopi viste, at disse parasitter var ultrasmalle bakterier.
Ved hjælp af disse spor udtænkte vi en metode til hurtigt at etablere binære cokulturer af Saccharibacteria med deres partnere ved at filtrere plak og andre mundtlige prøver gennem et 0,2 μm filter, indsamle celler i filtrat ved centrifugering og bruge dem til at inficere kulturer af kandidatværtsbakterier. Denne metode har den fordel at undgå berigelseskulturer, som kan overvældes med hurtigt voksende organismer. Det undgår også brugen af antibiotika, som kan stoppe væksten af enten den målrettede Saccharibacteria arter eller deres værter. Ved hjælp af den metode, der demonstreres her, har vi med succes dyrket 32 isolater fra Saccharibacteria phylum.
Vores metode til filtrering af plak og anvendelse af den på rene kulturer af værtsorganismer er i høj grad baseret på tidligere observationer af den første kultiverede Saccharibacteria, ‘Nanosynbacter lyticus’ stamme TM7x11,14,15. I betragtning af den lille cellestørrelse udledte vi, at de kunne adskilles fra plak ved hjælp af et filter og koncentreret med centrifugering. For det andet, da disse organismer lever som parasitter, ville disse celler rene kulturer af værter give dem mulighed for at indgå i en symbiose og vokse som binære kulturer.
En fordel ved denne metode er, at den ikke kræver en berigelseskultur eller selektivt tryk. ‘Nanosynbacter lyticus’ stamme TM7x blev dyrket fra en berigelseskultur ved hjælp af streptomycin som selektivt middel, som sekventering havde antydet ville være effektiv til berigelse for Saccharibacteria. Tilfældigvis er værten for ‘Nanosynbacter lyticus’ Schaalia odontolytica, kendt for at være resistent over for streptomycin16. Brug af antibiotika som selektivt middel kan også forhindre værtsorganismen i at vokse, hvilket igen ville udelukke væksten af Saccharibacteria.
Et større problem med at bruge berigelseskulturer er, at hurtigt voksende organismer hurtigt vil fortrænge organismer af interesse. I mundhulen kan streptokokkusarter for eksempel vokse hurtigt og, hvis sukker er til stede i vækstmediet, producere nok syre til at forsure mediet og yderligere vælge mod organismer af interesse. Ved at undgå en berigelseskultur og selektiv antibiotika giver vores metode en generel tilgang, der kan anvendes på en bredere vifte af Saccharibacteria og potentielle værter uden komplikationer fra disse andre metoder.
Der er nogle hindringer for den metode, der præsenteres her. For det første antager denne metode, at Saccharibacteria lever i en binær kultur. Vi har ikke testet kombinationer af trinære eller ternære kulturer for at måle deres effektivitet, men der er sandsynligvis Saccharibacteria, der kræver vækstfaktorer, som en enkelt værtsorganisme ikke kan levere. Test af store kombinationer af orale bakterier, der kunne understøtte væksten af Saccharibacteria ville være en skræmmende opgave. For det andet antager metoden, at alle Saccharibacteria er små nok til at passere gennem et 0,2 μm filter. Det kunne være, at andre Saccharibacteria er større end antaget, og filteret er at vælge mod disse organismer. Et filter med en større porestørrelse kan bruges, men dette risikerer at tillade mere uønskede orale bakterier i den inficerede co-kultur. Endelig er det meget vanskeligt at finde værtsarter uden for dem, der allerede er blevet offentliggjort. Hidtil er de eneste succesfulde værter arter fra slægterne Actinomyces, Schaalia, Arachnia og Cellulosimicrobium, alle medlemmer af phylum Actinobacteria15,17,18. Disse værter understøtter dog kun væksten af specifikke Saccharibacteria. For at dyrke flere arter af Saccharibacteria skal mange flere værter udforskes.
Vi håber, at den metode, der præsenteres her, vil støtte fremtidig forskning af Saccharibacteria og andre HLR-organismer. Metagenomisk sekventering tyder på, at disse organismer også har små genomer og mistænkes for at være symbionter eller stole på det lokale mikrobielle samfund til at levere metabolitter og andre faktorer, der er kritiske for deres overlevelse19. En lignende filtreringsstrategi kunne bruges til at isolere disse organismer, forudsat at de er små nok, og at deres værtsorganismer kan dyrkes. De metoder, der er beskrevet her, er et første skridt til at bringe de magtfulde værktøjer i laboratoriekulturen til denne store og forskelligartede gruppe af bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at takke Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong Han og Batbileg Bor for nyttige diskussioner og for at give bakterielle stammer. Vi takker Susan Yost og Jessica Woods for mikrobiel teknisk bistand. Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af The National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health under tildeling numre R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) og T32 DE007327 (AJC). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de nationale sundhedsinstitutters officielle synspunkter.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Pipette tips – 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
Pipette tips – 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
Pipette tips – 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
Pipette tips – 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Swin-Lok Filter – 47mm | Whatman | 4200400 | |
SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
Syringes – 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |