Vi demonstrerer en metode for å isolere vanskelig å vokse medlemmer av den nye bakterielle phylum, Saccharibacteria, ved å filtrere tannplakk og co-culturing med vertsbakterier.
Mange bakteriearter kan ikke dyrkes i laboratoriet ved hjelp av standardmetoder, noe som utgjør en betydelig barriere for å studere det meste av mikrobielt mangfold på jorden. Nye tilnærminger kreves for å dyrke disse ukulturerte bakteriene slik at undersøkere effektivt kan studere sin fysiologi og livsstil ved hjelp av de kraftige verktøyene som er tilgjengelige i laboratoriet. Candidate Phyla Radiation (HLR) er en av de største gruppene av ukulturerte bakterier, som består av ~ 15% av det levende mangfoldet på jorden. Den første isolasjonen av denne gruppen var medlem av Saccharibacteria phylum, ‘Nanosynbacter lyticus‘ stamme TM7x. TM7x er en uvanlig liten bakterie som lever som symbiont i direkte kontakt med en bakteriell vert, Schaalia odontolytica, stamme XH001. Ved å dra nytte av den uvanlig små cellestørrelsen og livsstilen som en symbiotisk organisme, utviklet vi en protokoll for raskt å dyrke Saccharibacteria fra tannplakk. Denne protokollen vil vise hvordan man filtrerer en suspensjon av tannplakk gjennom et 0,2 μm filter, og konsentrerer deretter de samlede Saccharibacteria-cellene og infiserer en kultur av vertsorganismer. Den resulterende kokulturen kan passeres da enhver normal bakteriekultur og infeksjon bekreftes av PCR. Den resulterende binære kulturen kan opprettholdes i laboratoriet og brukes til fremtidige eksperimenter. Selv om forurensning er en mulighet, kan den binære kulturen renses ved enten ytterligere filtrering og reinfeksjon av vert, eller ved å plating binær kultur og screening for infiserte kolonier. Vi håper denne protokollen kan utvides til andre utvalgstyper og miljøer, noe som fører til dyrking av mange flere arter i HLR.
Kultivering av nye arter av bakterier og å bringe dem inn i laboratoriet gjør det mulig for kraftige eksperimenter å bedre forstå deres fysiologi og bredere interaksjoner i deres mikrobielle samfunn. Selv om det finnes kulturfrie metoder for å forhøre disse spørsmålene (f.eks. “meta-omics”), gjør de komplekse interaksjonene mellom ulike mikrobielle populasjoner det vanskelig å erte fra hverandre enkeltvariabler og nå meningsfulle konklusjoner. Mens dyrking av bakterier har mange fordeler, er det mange potensielle barrierer for å isolere en bakterie og vokse den i ren kultur. Potensielle spesifikke vekstkrav inkluderer pH, oksygenspenning, vitaminer, vekstfaktorer, signalmolekyler eller til og med direkte cellekontakt for å fremkalle vekst1. Det antas imidlertid at spesifikke auxotrophies er den primære avskrekkende for å dyrke nye arter av bakterier. Standard medieformuleringer mangler mange næringsstoffer som kreves av ukulturerte bakterier, for eksempel spesifikke vitaminer eller karbonkilder. Disse manglende molekylene kan være nøkkelen til fysiologien til de ukulturerte bakteriene og leveres vanligvis av enten en annen organisme i det mikrobielle samfunnet eller en vertsorganisme. For eksempel kan komplekse karbohydrater som mucins leveres av dyreverter. Å legge disse til media har tillatt dyrking av flere bakterier fra dyremot, inkludert Akkermansia muciniphila og Mucinivorans hirudinis2,3,4. Mange patogene bakterier har utviklet evnen til å bruke jern bundet til hemin i dyreceller, inkludert det orale patogenet Porphyromonas gingivalis5. I laboratoriet kan veksten av Porphyromonas og andre organismer stimuleres ved tilsetning av hemin6.
Nylig har mange gjennombrudd i culturing nye isolasjoner av bakterier kommet gjennom co-culturing, ved hjelp av en “feeder” organisme for å gi spesifikke faktorer til ukulturerte bakterier som er nødvendige for deres vekst. En elegant studie av Vartoukian og kolleger viste at siderophores, jernbindende molekyler produsert av bakterier, stimulerte veksten av flere nye orale isolasjoner. Pyoverdines, en type siderophore produsert av pseudomonad arter, ble vist å lette veksten av en roman Prevotella arter7betydelig . I samme studie ble den første orale isolasjonen for phylum Chloroflexi dyrket, og brukte også F. nucleatum som hjelper for å gi noen ennå ukjent forbindelse7. Mer nylig ble en bakterie fra slekten Ruminococcaceae isolert ved hjelp av Bacteroides fragilis som hjelperorganisme8. Det ble senere vist at gamma aminosmørsyre (GABA), en hemmende nevrotransmitter, var nødvendig for vekst på laboratoriemedier. Bruk av materorganismer har vist seg å være en nøkkelstrategi for å etterligne spesifikke mikromiljø der ukulturerte bakterier vokser, og er mer effektive enn kontinuerlig å reformulere vekstmedier med forskjellige tilsetningsstoffer i varierende konsentrasjoner.
En av de største gruppene av ukulturerte bakterier er i “Candidate Phyla Radiation” (HLR), en monofyletisk gruppe av flere kandidatbakterielle phyla9,10. I skrivende stund har bare medlemmer av Saccharibacteria-fylumen i HLR blitt dyrket i laboratoriet. Den første isolerende, ‘Nanosynbacter lyticus’ stamme TM7x, ble isolert ved hjelp av antibiotika streptomycin, som hadde blitt spådd å berike for den ukulturerte TM711,12. En viktig oppdagelse av dette arbeidet var at den nye isolasjonen vokste som en parasitt som vokste i direkte kontakt med en bakteriell vert, Schaalia odontolytica, og mikroskopi viste at disse parasittene var ultrasmallbakterier.
Ved hjelp av disse ledetrådene utviklet vi en metode for raskt å etablere binære kokulturer av Saccharibacteria med partnerne sine ved å filtrere tannplakk og andre orale prøver gjennom et 0,2 μm filter, samle celler i filtratet ved sentrifugering og bruke dem til å infisere kulturer av kandidatvertbakterier. Denne metoden har fordelen av å unngå berikelseskulturer, som kan overveldes med raskt voksende organismer. Det unngår også bruk av antibiotika, noe som kan stoppe veksten av enten de målrettede Saccharibacteria-artene eller deres verter. Ved hjelp av metoden som er demonstrert her, har vi vellykket dyrket 32 isolasjoner fra Saccharibacteria-phylum.
Vår metode for filtrering av plakk og påføring av den på rene kulturer av vertsorganismer er i stor grad basert på tidligere observasjoner om den første kultiverte Saccharibacteria, ‘Nanosynbacter lyticus’ stamme TM7x11,14,15. Gitt den lille cellestørrelsen, utledet vi at de kunne skilles fra tannplakk ved hjelp av et filter og konsentrert med sentrifugering. For det andre, ettersom disse organismene lever som parasitter, vil det å gi disse cellene rene kulturer av verter tillate dem å gå inn i en symbiose og vokse som binære kulturer.
En fordel med denne metoden er at den ikke krever en berikelseskultur eller selektivt trykk. ‘Nanosynbacter lyticus’ stamme TM7x ble dyrket fra en berikelseskultur ved hjelp av streptomycin som et selektivt middel, som sekvensering hadde antydet ville være effektiv til å berike for Saccharibacteria. Fortuitously, verten for ‘Nanosynbacter lyticus’ Schaalia odontolytica, er kjent for å være motstandsdyktig mot streptomycin16. Bruk av antibiotika som selektivt middel kan også forhindre at vertsorganismen vokser, noe som igjen vil utelukke veksten av Saccharibacteria.
Et større problem med å bruke berikelseskulturer er at raskt voksende organismer raskt vil fortrenge organismer av interesse. I munnhulen, for eksempel, kan Streptococcus-arter vokse raskt, og hvis sukker er tilstede i vekstmediet, produsere nok syre til å surgjøre mediet, og videre velge mot organismer av interesse. Ved å unngå en berikelseskultur og selektiv antibiotika, gir vår metode en generell tilnærming som kan brukes på et bredere spekter av Saccharibacteria og potensielle verter uten komplikasjoner av disse andre metodene.
Det er noen hindringer for metoden som presenteres her. For det første antar denne metoden at Saccharibacteria lever i en binær kultur. Vi har ikke testet kombinasjoner av trinære eller ternære kulturer for å måle effektiviteten, men det er sannsynligvis Saccharibacteria som krever vekstfaktorer som en enkelt vertsorganisme ikke kan levere. Å teste de enorme kombinasjonene av orale bakterier som kan støtte veksten av Saccharibacteria ville være en skremmende oppgave. For det andre antar metoden at alle Saccharibacteria er små nok til å passere gjennom et 0,2 μm filter. Det kan være at andre Saccharibacteria er større enn antatt, og filteret velger mot disse organismene. Et filter med større porestørrelse kan brukes, men dette risikerer å tillate mer uønskede orale bakterier i den infiserte samkulturen. Til slutt er det svært vanskelig å finne vertsarter utenfor de som allerede er publisert. Så langt er de eneste vellykkede vertene arter fra slekten Actinomyces, Schaalia, Arachnia og Cellulosimicrobium, alle medlemmer av phylum Actinobacteria15,17,18. Imidlertid støtter disse vertene bare veksten av spesifikk Saccharibacteria. For å dyrke flere arter av Saccharibacteria, må mange flere verter utforskes.
Vi håper metoden som presenteres her vil hjelpe fremtidig forskning av Saccharibacteria og andre HLR-organismer. Metagenomisk sekvensering antyder at disse organismene også har små genomer og mistenkes å være symbionter eller stole på det lokale mikrobielle samfunnet for å levere metabolitter og andre faktorer som er kritiske for deres overlevelse19. En lignende filtreringsstrategi kan brukes til å isolere disse organismene, forutsatt at de er små nok og at vertsorganismene deres kan dyrkes. Metodene beskrevet her er et første skritt for å bringe de kraftige verktøyene i laboratoriekulturen til denne store og mangfoldige gruppen av bakterier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Anne Tanner, Bruce Paster, Heike Boisvert, Xuesong He og Batbileg Bor for nyttige diskusjoner og for å gi bakteriestammer. Vi takker Susan Yost og Jessica Woods for mikrobiell teknisk assistanse. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av The National Institute of Dental and Craniofacial Research of the National Institutes of Health under tildelingsnumre R37 DE016937 (FED), R01 DE024468 (FED) og T32 DE007327 (AJC). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.
Agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
Alphaimager | Cell Biosciences | FluorChem HD2 | Or equivalent UV gel imaging system |
Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Brain Heart Infusion Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211059 | Or other growth media suitable for target organisms |
Centrifuge Rotor 70-Ti | Beckman Coulter | 337922 | |
Cryovials | Fisher Scientific | 12-567-500 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad | 1645052 | |
Electrophoresis Rig | Bio-Rad | 1704467 | |
Filter Forceps | Millipore Sigma | XX6200006P | Not essential, helps ensure filters are not punctured during handling |
Glycerol | Fisher Scientific | G33-500 | |
GoTaq Green Mastermix | Promega | M7122 | |
Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | 950040025 | Or equivalent thermocycler for PCR |
MgCl2 solution 25mM | Promega | A3513 | |
Molecular Biology grade water | Fisher Scientific | BP2819100 | |
O2 Control InVitro Glove Box | Coy Laoratories | 031615 | If needed for microaerobic organisms |
Optima L-100 XP High Speed Centrifuge | Beckman Coulter | 8043-30-1124 | |
P-10 micro pipette | Gilson | F144802 | |
P-1000 micro pipette | Gilson | F123601G | |
P-2 micro pipette | Gilson | F144801 | |
P-20 micro pipette | Gilson | F123600 | |
P-200 micro pipette | Gilson | F123602G | |
PBS | Fisher Scientific | BP399500 | |
PCR tubes 0.2 mL | Fisher Scientific | 14-230-205 | |
Peptone | Fisher Scientific | BP1420-500 | |
Pipette tips – 10 μL | Fisher Scientific | 02-717-157 | |
Pipette tips – 1000 μL | Fisher Scientific | 02-717-166 | |
Pipette tips – 20 μL | Fisher Scientific | 02-717-161 | |
Pipette tips – 200 μL | Fisher Scientific | 02-717-165 | |
Polycarbonate filters – 47mm, 0.2 μm pore size | Millipore | GTTP04700 | |
Screw-cap conical centrifuge tubes 15 mL | Falcon | 352096 | Or other tube suitable for bacterial culture |
Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
Swin-Lok Filter – 47mm | Whatman | 4200400 | |
SYBR Safe DNA Gel stain | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
Syringes – 20 mL | Fisher Scientific | 14-955-460 | |
TAE Buffer (50x) concentrate | Fisher Scientific | P1332500 | |
Thickwall Polycarbonate 25 x 89 mm (26.3mL capacity) centrifuge tubes with caps | Beckman Coulter | 355618 | |
Tryptic Soy Blood Agar Plates | Northeast Laboratory Services | P1100 | Or other agar plate sufficient for growth of host organisms |
Tryptic Soy Broth (dehydrated powder) | Becton-Dickinson | 211825 | Or other growth media suitable for target organisms |
Vinyl Anaerobic Chamber | Coy Laboratories | 032714 | If needed for anaerobic organisms |
Vortex mixer | Scientific Industries | SI-0236 | |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-500 |