마우스 메가카요시테 전조자의 격리
Summary
이 방법은 마우스 대퇴골, 티바이어스 및 골반 뼈로부터 MEP 및 MKp의 혈류 세포질에 의한 정화를 설명합니다.
Abstract
골수 메가카요세포는 혈액 혈소판의 생산을 보장하는 큰 폴리플로이드 세포입니다. 그(것)들은 거대 karyopoiesis를 통해 조혈 줄기 세포에서 생겨나. 이 과정의 최종 단계는 복잡하고 고전적으로 이중성 메가카요세포-에리스로세포 전구체(MEP)와 단능한 메가카요시테 전조자(MKp)를 포함한다. 이 인구는 선의의 거대 카르요세포의 형성을 선행하고, 그 격리와 특성화는 거대 카르요세포 형성의 강력하고 편견없는 분석을 허용할 수 있었다. 이 프로토콜은 마우스 골수에서 조혈 세포를 수집하는 절차를 자세히 제시, 자기 고갈을 통해 조혈 선조의 농축과 마지막으로 매우 정제 MEP와 MKp 인구를 산출 세포 선별 전략. 첫째, 골수 세포는 대퇴골, 경골 및 또한 일강 문장, 조혈 선조의 높은 수를 포함하는 뼈에서 집합된다. iliac 문장 뼈의 사용은 마우스 당 얻은 총 세포 수를 크게 증가시키고 따라서 동물의 더 윤리적 사용에 기여한다. 450nm 자성 구슬을 사용하여 자기 계보 고갈을 최적화하여 유동 세포측정에 의한 매우 효율적인 세포 선별을 가능하게 했습니다. 마지막으로, 프로토콜은 두 개의 고도로 정제 된 메가 카요 세포 선조 모집단의 정렬을위한 라벨링 및 게이팅 전략을 제시합니다 : MEP (Lin–Sca-1–c-Kit+CD16 / CD9 dim ) 및 MKp (Lin– Sca-1–c 키트+CD16 + CD16 +CD16 + CD16 – CD16 – CD16 – CD16 – CD16 – CD16 + CD16 + CD16 + CD10 + CD10 + CD9dim)및 CD16 + CD16 + CD16 + CD16+CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD16 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10 + CD10+ ). 이 기술은 구현하기 쉽고 i) 그들의 정체성과 생물학의 깊은 지식에 대한 분자 특성화를 수행하기에 충분한 세포 물질을 제공합니다, ii) 체외 분화 소사, 그 메가 카르요세포의 성숙의 메커니즘의 더 나은 이해를 제공 할 것입니다, 또는 iii) 자신의 마이크로 환경과의 상호 작용의 체외 모델.
Introduction
혈액 혈소판은 거대 카르요세포에 의해 생성됩니다. 이러한 큰 폴리플로이드 세포는 골수에 위치하며 모든 혈액 세포는 혈액 세포(HSC)1에서유래된다. 골수에 있는 거대 카르요세포의 생산의 고전적인 통로는 HSC에서 유래하고 점진적으로 그들의 분화 잠재력을 제한하는 다른 선조의 생성을 관련시킵니다2. 메가카요시틱 혈통에 대한 헌신에 서명한 첫 번째 선조는 에리스로이드 세포와 메가카요세포3,4,5를모두 생산할 수 있는 양성선조인 메가카르요세포-에리스로세포 전구(MEP)이다. 그런 다음 MEP는 혈소판을 생산할 수 있는 성숙한 메가카요시테로 분화하는 단능한 전구체/전구체(MKp)를 생성합니다. 이 선조의 생성에 관련되었던 기계장치는, megakaryocytes로의 그들의 분화 및 성숙 뿐 아니라 복잡하고 부분적으로만 이해됩니다. 추가적으로, 이러한 세포의 분화 잠재력과 본질적인 약정 수준의 관점에서 MEP 인구의 이질성은 여전히 불분명하다. 이러한 프로세스를 해독하기 위해서는 미세 분자 및 단일 세포 분석을 위해 MEP 및 MKp의 정제 된 인구를 얻거나 (또는 액세스 할 수 있음)하는 것이 필수적입니다.
몇몇 연구는 마우스6,7,8에서거대 핵세포 계보에 전념하는 선조의 식별을 위한 세포 표면 마커의 특정 조합을입증했습니다. 이러한 방법에서 마우스로부터 MEP 및 MKp의 정제를 허용하는 방법이 고안되었다. 이 방법은 많은 수의 분석에 대해 적절한 수와 품질로 세포를 얻기 위해 최적화되었습니다. 윤리적 고려 사항을 염두에 두고 실험에 관련된 동물의 수를 최소화하기 위해 대퇴골과 경골, 그리고 또한 일강 문장에서 골수를 수확하도록 유도했습니다. 이 뼈는 높은 주파수와 조혈 선조의 수를 포함하고 긴 뼈 수확 도중 손상된 시간의 대부분입니다. 여기에 이 뼈의 신뢰할 수 있는 컬렉션에 대 한 자세한 방법은 소개.
최적화의 두 번째 기준은 고도로 정제된 세포 집단을 생산하는 것입니다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS)는 관심있는 세포의 정제 된 인구를 얻기 위해 선택의 방법입니다. 그러나, 낮은 수익률은 관심의 세포 인구가 매우 드물 때 도달한다. 따라서 농축 절차가 필요합니다. 이 프로토콜에서는 마그네틱 구슬을 사용하여 음수 선택 절차를 선택했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에 설명된 방법은 마우스 MEP 및 MKp의 추출 및 정제를 허용합니다. 프로토콜의 최적화에 있는 중요한 매개 변수는 대부분의 분자 및 세포 기지를 둔 분석과 호환될 세포의 충분한 수를 얻는 것이었습니다. 조혈 세포 추출을 위한 마우스 뼈 수집의 일반적인 사례는 일반적으로 각 마우스의 대퇴골과 티바이어스를 모두 수확하는 것으로 구성됩니다. 골반 뼈, 조혈 물질의 또 다른 소스, 따라서…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 모니크 프룬드, 캐서린 지셀, 케티에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique)에 의해 지원되었으며 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01에서 Henri.de 라에 의해 지원되었습니다. 솔.
Materials
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Antibody Gr-1-biotin | eBioscience | 13-5931-85 | Magnetic depletion |
| Antibody B220-biotin | eBioscience | 13-0452-85 | Magnetic depletion |
| Antibody Mac-1-biotin | eBioscience | 13-0112-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD3e-biotin | eBioscience | 13-0031-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD4-biotin | eBioscience | 13-9766-82 | Magnetic depletion |
| Antibody CD5-biotin | eBioscience | 13-0051-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD8a-biotin | eBioscience | 13-0081-85 | Magnetic depletion |
| Antibody TER119-biotin | eBioscience | 13-5921-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD127-biotin | eBioscience | 13-1271-85 | Magnetic depletion |
| Antibody CD45-FITC | eBioscience | 11-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PE | eBioscience | 12-0451-83 | Cell sorting |
| Antibody TER119-APC | eBioscience | 17-5921-83 | Cell sorting |
| Antibody CD45-PECy7 | eBioscience | 25-0451-82 | Cell sorting |
| Antibody CD45-biotin | eBioscience | 13-0451-85 | Cell sorting |
| Antibody CD9-FITC | eBioscience | 11-0091-82 | Cell sorting |
| Antibody c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | Cell sorting |
| Antibody Sca-1-PE | eBioscience | 12-5981-83 | Cell sorting |
| Antibody CD16/32-PE | eBioscience | 12-0161-83 | Cell sorting |
| Antibody CD150-PECy7 | eBioscience | 25-1502-82 | Cell sorting |
| Culture medium StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| Dissection pad | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| Ethanol | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| Forceps | Euronexia | P-120-AS | |
| Glass pasteur pipette | Dutscher | 42011 | |
| Magnet : DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| Magnetic beads: Dynabeads Sheep Anti-Rat IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| Newborn Calf Serum | Dutscher | 50750-500 | |
| Red Cell Lysis solution | BD Bioscience | 555899 | |
| Scalpels | Fisher Scientific | 12308009 | |
| Scissors | Euronexia | C-165-ASB | |
| Sterile 1 mL syringes | BD Bioscience | 303172 | |
| Sterile 15mL tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Sterile 5mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| Sterile 5mL polystyrene tubes | Falcon | 352054 | |
| Sterile tubes with 70µm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
| Sterile petri dish | Falcon | 353003 | |
| Streptavidin-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | Cell sorting |
| Tube roller | Benchmark Scientific | R3005 |
References
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