小鼠新鲜骨髓外植体的丙酸盐形成动力学
Summary
在这里，我们详细介绍了骨髓外植体方法，从样品制备到显微载玻片分析，以评估在其生理环境中分化的巨核细胞形成丙酸盐的能力。
Abstract
巨核生成术的最后阶段导致成熟巨核细胞的细胞质延伸，即所谓的丙酸盐。关于使用 体外分化的巨核细胞形成丙酸盐的很多知识;然而，越来越多的证据表明，传统的培养系统并不能忠实地概括骨髓内部发生的分化/成熟过程。在这份手稿中，我们提出了一种最初由Thierry和Bessis于1956年描述的外植体方法，以可视化在其原生环境中成熟的巨核细胞，从而规避潜在的伪影和误解。通过冲洗小鼠的股骨收集新鲜的骨髓，切成0.5mm横截面，并置于含有生理缓冲液的37°C孵育室中。巨核细胞在外植体外围逐渐可见，并在与摄像机耦合的倒置显微镜下观察长达6小时。随着时间的推移，巨核细胞改变其形状，一些细胞具有球形，而另一些细胞则发展出厚的延伸或延伸许多具有广泛分支的薄丙酸盐。进行定性和定量调查。该方法具有简单，可重复和快速的优点，因为存在许多巨核细胞，并且通常其中一半在6小时内形成丙酸盐，而培养的小鼠巨核细胞为4天。除了对突变小鼠的研究外，该方法的一个有趣的应用是直接评估丙酸盐延伸过程中的药理学药物，而不会干扰培养物中可能发生的分化过程。
Introduction
骨髓外植体技术最初由Thiéry和Bessis于1956年开发，用于将大鼠巨核细胞细胞质延伸的形成描述为血小板形成的初始事件1。使用相差和电影摄影技术，这些作者表征了成熟的圆形巨核细胞转化为”鱿鱼状”血小板细胞，其细胞质延伸显示出伸长和收缩的动态运动。这些手臂逐渐变薄，直到它们变成丝状，沿着手臂和尖端有小肿胀。这些典型的巨核细胞伸长，在体外和液体介质中获得，与固定骨髓中观察到的血小板有一定的相似性，其中巨核细胞通过正弦壁突出长延伸进入血液循环2，3。1994年TPO的发现和克隆，允许在培养物中区分巨核细胞，能够形成类似于骨髓外植体4，5，6中描述的丙酸盐延伸。然而，巨核细胞成熟在培养条件下的效率要低得多，特别是骨髓成熟的巨核细胞的广泛内部膜网络在培养的巨核细胞中发育不足，阻碍了对血小板生物发生机制的研究7，8。
我们在这里详细介绍了基于Thierry和Bessis的骨髓外植体模型，以实时跟踪小鼠巨核细胞的丙酸盐形成，这些巨核细胞在其原生环境中已经完全成熟，从而避免了可能的 体外 伪影和误解。在野生型成年小鼠中获得的结果被提出来说明巨核细胞扩展丙酸盐的能力，它们的形态和丙酸盐的复杂性。我们还引入了一种快速量化策略进行质量验证，以确保巨核细胞记录过程中的数据准确性和稳健性。这里介绍的协议是该方法的最新版本，作为书籍章节9发布。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里，我们描述了一种简单且低成本的体外方法，以评估巨核细胞延长在骨髓中生长的丙酸盐的效率。小鼠骨髓外植体模型有四个主要优点。首先，不需要高级技术技能。其次，获得巨核细胞延伸丙酸盐所需的时间相当短，外植体方法仅为6小时，而从小鼠祖细胞开始的常规培养方法至少为4天。第三，鉴于只需要少量的组织并且获得的结果是可重复的，它将所需的小鼠数量减少到最低限?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者希望感谢Jean-Yves Rinckel，Julie Boscher，Patricia Laeuffer，Monique Freund，Ketty Knez-Hippert的技术援助。这项工作得到了ANR（国家研究机构）Grant ANR-17-CE14-0001-01和ANR-18-CE14-0037的支持。
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
