דינמיקת היווצרות Proplatelet של מסלקי מח עצם טריים של עכבר
Summary
כאן, אנו מפרטים את שיטת הסבר מח העצם, מהכנת מדגם לניתוח שקופיות מיקרוסקופי, כדי להעריך את היכולת של מגהקריוציטים אשר הבדילו בסביבה הפיזיולוגית שלהם כדי ליצור מפיץ.
Abstract
השלב האחרון של megakaryopoiesis מוביל הרחבות ציטופלסמיות מ megakaryocytes בוגר, מה שנקרא proplatelets. הרבה נלמד על היווצרות proplatelet באמצעות מקרוציטיםבמבחנה- מובחנים; עם זאת, יש ראיות הולכות וגדלות לכך שמערכות תרבות קונבנציונליות אינן מסכמות בנאמנות את תהליך הבידול / ההתבגרות המתרחש בתוך מח העצם. בכתב יד זה, אנו מציגים שיטה מסבירה שתוארה בתחילה בשנת 1956 על ידי תיירי ובסיס לדמיין מגהקריוציטים שהבשילו בסביבתם הטבעית, ובכך לעקוף חפצים פוטנציאליים ופרשנויות שגויות. מח עצם טרי נאסף על ידי שטיפה של עצם הירך של עכברים, פרוסים 0.5 מ”מ חתך, ומניחים בתא דגירה ב 37 °C המכיל חיץ פיזיולוגי. מגה-קריוציטים נראים בהדרגה בפריפריה המהוללת ונצפתים עד 6 שעות תחת מיקרוסקופ הפוך בשילוב עם מצלמת וידאו. עם הזמן, megakaryocytes לשנות את צורתם, עם תאים מסוימים בעלי צורה כדורית ואחרים לפתח הרחבות עבות או הרחבת מדחפים דקים רבים עם הסתעפות נרחבת. מתבצעות חקירות איכותיות וכמותיות. שיטה זו יש את היתרון של להיות פשוט, לשחזור, ומהיר כמו megakaryocytes רבים נוכחים, ומחצית קלאסית מהם ליצור proplatelets ב 6 שעות לעומת 4 ימים עבור megakaryocytes עכבר מתורבת. בנוסף לחקר עכברים מוטנטיים, יישום מעניין של שיטה זו הוא הערכה פשוטה של הסוכנים הפרמקולוגיים על תהליך הרחבת ההתפשטות, מבלי להפריע לתהליך הבידול שעלול להתרחש בתרבויות.
Introduction
טכניקת הסבר מח העצם פותחה לראשונה על ידי תיירי ובסיס בשנת 1956 כדי לתאר את היווצרותם של תוספות ציטופלסמיות מקרוציטים של חולדה כאירוע ראשוני בהיווצרות טסיות דם1. באמצעות ניגודיות פאזה וטכניקות קולנועיות, מחברים אלה אפיינו את הפיכתם של מגה-קריוציטים עגולים בוגרים לתאי תרומבוציטוגניים “דמויי דיונון” עם הרחבות ציטופלסמיות המציגות תנועות דינמיות של התארכות והתכווצות. זרועות אלה הופכות בהדרגה דקות יותר עד שהן הופכות לפילפורם עם נפיחות קטנה לאורך הזרועות ובקצוות. אלה התארכות megakaryocyte טיפוסי, המתקבל במבחנה ובמדיה נוזלית, יש קווי דמיון מסוימים עם טסיות דם שנצפו במח עצם קבוע, שבו megakaryocytes לבלט הרחבות ארוכות דרך קירות הסינוסואיד לתוך זרימת הדם2,3. גילוי ושיבוט של TPO בשנת 1994, מותר להבדיל megakaryocytes בתרבות מסוגל ליצור הרחבות proplatelet הדומה לאלה המתוארים explants מח עצם4,5,6. עם זאת, התבגרות megakaryocyte הוא הרבה פחות יעיל בתנאי תרבות, במיוחד רשת הממברנה הפנימית הנרחבת של מקרוציטים מח עצם התבגרה מפותחת במגקריוציטים מתורבתים, מה שמעכב מחקרים על המנגנונים של ביוגנזה טסיות דם7,8.
אנו מפרטים כאן את מודל מוסף מח העצם, המבוסס על תיירי ובסיס, כדי לעקוב אחר היווצרות מפלגות בזמן אמת של מגהקריוציטים של עכברים, שהבשילו לחלוטין בסביבתם הטבעית, ובכך לעקוף חפצים במבחנה ופרשנויות שגויות. תוצאות המתקבלות בעכברים בוגרים מסוג בר מוצגות כדי להמחיש את היכולת של megakaryocyte להרחיב את הנפצים, המורפולוגיה שלהם ואת המורכבות של proplatelets. אנו מציגים גם אסטרטגיית כימות מהירה לאימות איכות כדי להבטיח דיוק ועמידות נתונים במהלך תהליך ההקלטה של megakaryocyte. הפרוטוקול המוצג כאן הוא הגרסה העדכנית ביותר של השיטה שפורסמה כפרק ספר בעבר9.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מתארים שיטת במבחנה פשוטה ובעלות נמוכה כדי להעריך את היעילות של megakaryocytes כדי להרחיב את פרופלטלטים אשר גדלו במח העצם. לדגם מסלק מח העצם לעכבר יש ארבעה יתרונות עיקריים. ראשית, אין צורך בכישורים טכניים מתקדמים. שנית, הזמן הדרוש כדי להשיג מקרוציטים מאריכים מרחיב הוא קצר למדי, רק 6 שעו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לז’אן-איב רינקל, ג’ולי בושר, פטרישיה לאופר, מוניק פרוינד, קטי קנז-היפפרט על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ANR (אגנס נשיונל דה לה Recherche) גרנט ANR-17-CE14-0001-01 ו ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
- Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
- Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
- Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
- Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
- Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101 (2018).
- Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
- Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
- Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).
