माउस फ्रेश बोन मैरो एक्सप्लांट्स की प्रोपलेट फॉर्मेशन डायनेमिक्स
Summary
यहां, हम बोन मैरो एक्सप्लांट विधि का विस्तार करते हैं, नमूना तैयारी से लेकर सूक्ष्म स्लाइड विश्लेषण तक, मेगाकारियोसाइट्स की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, जिन्होंने अपने शारीरिक वातावरण में प्रॉलेटलेट बनाने के लिए विभेदित किया है।
Abstract
मेगाकारियोपोइसिस के अंतिम चरण में परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स, तथाकथित प्रोपलेटलेट्स से साइटोप्लाज्मिक एक्सटेंशन होता है। इन विट्रो-विभेदित मेगाकारियोसाइट्स का उपयोग करके प्रॉप्लेलेट गठन के बारे मेंबहुत कुछ सीखा गया है; हालांकि, इस बात का सबूत बढ़ रहा है कि पारंपरिक संस्कृति प्रणालियां अस्थि मज्जा के अंदर होने वाली भेदभाव/परिपक्वता प्रक्रिया को ईमानदारी से पुनर्मूल्यांकन नहीं करती हैं । इस पांडुलिपि में, हम शुरू में थिएरी और बेसिस द्वारा 1 9 56 में वर्णित एक एक्सप्लांट विधि प्रस्तुत करते हैं ताकि मेगाकारियोसाइट्स की कल्पना की जा सके जो उनके मूल वातावरण में परिपक्व हो गए हैं, इस प्रकार संभावित कलाकृतियों और गलत व्याख्याओं को दरकिनार करते हैं। ताजा अस्थि मज्जा चूहों के फीमर को फ्लश करके एकत्र किए जाते हैं, 0.5 मिमी क्रॉस सेक्शन में कटा हुआ है, और एक इनक्यूबेशन कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखा जाता है जिसमें शारीरिक बफर होता है। मेगाकारियोसाइट्स एक्सप्लांट परिधि में धीरे-धीरे दिखाई देते हैं और एक वीडियो कैमरे के साथ मिलकर एक उल्टे माइक्रोस्कोप के नीचे 6 घंटे तक देखे जाते हैं। समय के साथ, मेगाकारियोसाइट्स अपना आकार बदलते हैं, कुछ कोशिकाओं के पास गोलाकार रूप होता है और अन्य मोटी एक्सटेंशन विकसित करते हैं या व्यापक ब्रांचिंग के साथ कई पतले प्रोपलेटलेट का विस्तार करते हैं। गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों जांच की जाती है । इस विधि में सरल, प्रजनन योग्य और तेज होने का लाभ है क्योंकि कई मेगाकारियोसाइट्स मौजूद हैं, और उनमें से आधे सुसंस्कृत माउस मेगाकारियोसाइट्स के लिए 4 दिनों की तुलना में 6 घंटे में प्रोपलेटलेट बनाते हैं। उत्परिवर्ती चूहों के अध्ययन के अलावा, इस विधि का एक दिलचस्प अनुप्रयोग संस्कृतियों में होने वाली भेदभाव प्रक्रिया में हस्तक्षेप किए बिना, प्रोपलेटेलेट विस्तार प्रक्रिया पर औषधीय एजेंटों का सीधा मूल्यांकन है।
Introduction
बोन मैरो एक्सप्लांट तकनीक को सबसे पहले 1956 में थिएरी और बेसिस द्वारा विकसित किया गया था ताकि प्लेटलेट निर्माण में प्रारंभिक घटना के रूप में चूहा मेगाकारियोसाइट साइटोप्लाज्मिक एक्सटेंशन केगठनका वर्णन किया जा सके। चरण के विपरीत और छायांकन तकनीकों का उपयोग करते हुए, इन लेखकों ने परिपक्व दौर मेगाकारियोसाइट्स के परिवर्तन को “स्क्विड-लाइक” थ्रोम्बोसाइटोजेनिक कोशिकाओं में चित्रित किया, जिसमें साइटोप्लाज्मिक एक्सटेंशन के साथ विस्तार और संकुचन के गतिशील आंदोलनों को दिखाया गया था। ये हथियार उत्तरोत्तर पतले हो जाते हैं जब तक कि वे बाहों के साथ और सुझावों पर छोटी सूजन के साथ फिलीफॉर्म न हो जाएं। इन विशिष्ट मेगाकार्योसाइट विस्तार, विट्रो और तरल मीडिया में प्राप्त, निश्चित अस्थि मज्जा में मनाए गए प्लेटलेट्स के साथ कुछ समानताएं हैं, जहां मेगाकारियोसाइट्स साइनसॉयड दीवारों के माध्यम से रक्त परिसंचरण2,3मेंलंबेविस्तार को फैलाते हैं। 1994 में टीपीओ की खोज और क्लोनिंग ने संस्कृति में मेगाकारियोसाइट्स को अंतर करने की अनुमति दी, जो बोन मैरोएक्सप्लांट4,5,6में वर्णित प्रोपलेट एक्सटेंशन के समान है। हालांकि, मेगाकारियोसाइट परिपक्वता संस्कृति की स्थितियों में बहुत कम कुशल है, विशेष रूप से अस्थि मज्जा परिपक्व मेगाकारियोसाइट्स का व्यापक आंतरिक झिल्ली नेटवर्क सुसंस्कृत मेगाकारियोसाइट्स में अविकसित है, प्लेटलेट बायोजेनेसिस7,8के तंत्र पर अध्ययन में बाधा डालता है।
हम यहां विस्तार से थेरी और बीसिस पर आधारित बोन मैरो एक्सप्लांट मॉडल, माउस मेगाकारियोसाइट्स के वास्तविक समय के प्रोपलेट गठन में पालन करने के लिए, जो अपने मूल वातावरण में पूरी तरह से परिपक्व हो गए हैं, इस प्रकार विट्रो कलाकृतियों और गलत व्याख्याओं में संभव दरकिनार करते हैं। जंगली प्रकार के वयस्क चूहों में प्राप्त परिणामों को प्रोपलेटलेट, उनकी आकृति विज्ञान और प्रोपलेटर की जटिलता का विस्तार करने के लिए मेगाकार्योसाइट की क्षमता को चित्रित करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। हम मेगाकारियोसाइट रिकॉर्डिंग प्रक्रिया के दौरान डेटा सटीकता और मजबूती सुनिश्चित करने के लिए गुणवत्ता सत्यापन के लिए एक तेजी से मात्रात्मक रणनीति भी पेश करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक पुस्तक अध्याय के रूप में प्रकाशित विधि का सबसे हाल ही में संस्करण है9पहले ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम बोन मैरो में बड़े हुए प्रोपलेट्स का विस्तार करने के लिए मेगाकारियोसाइट्स की दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल और कम लागत वाली इन विट्रो विधि का वर्णन करते हैं। माउस के लिए बोन मैरो एक्स?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक तकनीकी सहायता के लिए जीन-येव्स रिंकेल, जूली बोशर, पेट्रीसिया लैफर, मोनिक फ्रायंड, केट्टी Knez-Hippert का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । इस काम को एएनआर (एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे) ग्रांट एएनआर-17-सीई14-0001-01 और एएनआर-18-सीई14-0037 ने सपोर्ट किया है ।
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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