マウスの新鮮な骨髄のプロ血小板形成ダイナミクス
Summary
ここでは、骨髄外植法について詳述し、サンプル調製から顕微鏡スライド解析まで、それらの生理環境において分化した巨核球がプロ血小板を形成する能力を評価する。
Abstract
巨核代の最後の段階は、成熟した巨核球、いわゆるプロ血小板からの細胞質拡張につながります。多くの体 外– 分化された巨核球を使用してプロ血小板形成について学んできました;しかし、従来の培養系では、骨髄の内部で起こる分化/成熟過程を忠実に再現していないという証拠が増えています。本稿では、1956年にティエリーとベシスが最初に述べた外植法を紹介し、その原生環境で成熟した巨核球を可視化し、潜在的な人工物や誤解を回避する。生骨マロウは、マウスの大腿骨を洗い流すことによって採取され、0.5mmの断面にスライスし、生理学的緩衝液を含む37°Cのインキュベーションチャンバーに入れる。巨核球は、外植周囲で徐々に見えるようになり、ビデオカメラに結合された反転顕微鏡の下で最大6時間観察されます。時間が経つにつれて、巨核球は形状を変化させ、球形を有する細胞もあれば、厚い伸長を発症する細胞や、広範な分岐を伴う多くの薄いプロ血小板を拡張する細胞もある。質的な調査と定量的な調査の両方が行われます。この方法は、多数の巨核球が存在するように単純で再現性があり、速く、そしてそれらの半分が培養マウス巨核球の4日間と比較して6時間でプロ血小板を形成するという利点を有する。変異マウスの研究に加えて、この方法の興味深い応用は、培養で起こり得る分化プロセスを妨げることなく、プロ血小板拡張プロセス上の薬理学的薬剤の簡単な評価である。
Introduction
骨髄外植技術は、血小板形成1における初期事象としてラット巨核球細胞質拡張の形成を記述するために、1956年にティエリーとベシスによって最初に開発された。これらの著者らは、位相コントラストと映画技術を用いて、成熟した円形巨核球を、伸びと収縮の動的な動きを示す細胞質拡張を有する「イカ様」血小板細胞細胞への変換を特徴付けた。これらの腕は、腕に沿って、先端に小さな腫れでフィリフォームになるまで徐々に薄くなります。これらの典型的な巨核球伸びは、インビトロおよび液体培地で得られ、固定骨髄で観察される血小板と一定の類似性を有し、そこで巨核球が血液循環2,3に正弦波壁を通って長い伸長を突き出ている。1994年のTPOの発見とクローニングにより、骨髄外植4、5、6に記載のものに似たプロ血小板拡張を形成できる培養物中の巨核球を区別することができた。しかしながら、巨核球成熟は培養条件においてはるかに効率が悪く、特に骨髄成熟した巨核球の広範な内膜網は培養された巨核球において未開発であり、血小板生物新生7,8のメカニズムに関する研究を妨げている。
ここでは、ティエリーとベシスに基づく骨髄外植モデルを、ネイティブ環境で完全に成熟したマウス巨核球のリアルタイムプロ血小板形成に従い、 体外 のアーティファクトや誤解の可能性を回避します。野生型成虫マウスで得られた結果は、巨核球がプロ血小板を拡張する能力、その形態およびプロ血小板の複雑さを示すために提示される。また、巨核球記録工程におけるデータの正確性と堅牢性を確保するための、品質検証のための迅速な定量化戦略も導入します。ここで紹介したプロトコルは、本の章として出版された最新バージョンの方法です 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、骨髄で増殖したプロ血小板を拡張する巨核球の効率を評価する簡単で低コストの インビトロ 法について説明する。マウスの骨髄外植モデルには、4つの主な利点があります。第一に、高度な技術スキルは必要ありません。第2に、巨核球拡張プロ血小板を得るのに必要な時間は、マウス前駆物質から始まる従来の培養法に対して最低4日間に比べ、外植法に対して6時間という?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、ジャン=イヴ・リンケル、ジュリー・ボッシャー、パトリシア・レーファー、モニーク・フロイント、ケティ・クネズ=ヒッパートの技術支援に感謝したいと考えている。この作品は、ANR(アジェンス・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ)グラントANR-17-CE14-0001-01とANR-18-CE14-0037によってサポートされています。
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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