마우스 신선한 골수 이별의 프로플라츠 형성 역학
Summary
여기서, 우리는 골수 각질 방법을 자세히, 샘플 준비에서 현미경 슬라이드 분석에, 프로 플라츠판을 형성하는 그들의 생리 환경에서 분화 한 메가 카요 세포의 능력을 평가하기 위해.
Abstract
메가카요포이시스의 마지막 단계는 성숙한 거대 카르요세포, 소위 프로플라츠에서 세포질 확장으로 이어집니다. 체외에서 -분화 된 메가 카요세포를 사용하여 프로 플라츠판 형성에대해 많은 것을 배웠습니다. 그러나, 기존의 문화 시스템이 골수 내부의 장소를 취하는 분화 / 성숙 과정을 충실하게 재구성하지 않는다는 증거가 증가하고 있다. 이 원고에서는 1956년 티에리와 베시스가 원래 설명한 절묘한 방법을 제시하여 자신의 토착 환경에서 성숙한 거대 카르요세포들을 시각화하여 잠재적인 유물과 오해를 우회합니다. 신선한 골새끼는 마우스의 대퇴골을 플러시하여 수집되고, 0.5mm 단면으로 슬라이스하고, 생리적 완충액을 함유하는 37°C의 인큐베이션 챔버에 배치된다. 메가카요세포는 축출 주변에서 점진적으로 볼 수 있게 되고 비디오 카메라에 결합된 반전된 현미경으로 최대 6시간까지 관찰됩니다. 시간이 지남에 따라, 메가 카요 세포는 구형 형태를 가지고 다른 두꺼운 확장을 개발하거나 광범위한 분기와 많은 얇은 proplatelet을 확장, 모양을 변경합니다. 정성적 및 정량적 조사가 모두 수행됩니다. 이 방법은 수많은 거대 카르요세포가 존재하므로 간단하고 재현 가능하며 빠르며, 그 중 절반은 배양 마우스 메가카요세포에 대한 4일에 비해 6시간 만에 프로플라틀렛을 형성한다는 장점이 있다. 돌연변이 마우스의 연구 외에도, 이 방법의 흥미로운 적용은 배양에서 발생할 수 있는 분화 과정을 방해하지 않고, 프로플라틀 확장 과정에 대한 약리학제제의 간단한 평가이다.
Introduction
골수 각질 기술은 1956년 티에리와 베시스에 의해 처음 개발되어 혈소판 형성1의초기 이벤트로서 쥐 메가카요세포 세포질 확장의 형성을 기술하였다. 위상 대비 및 촬영 기술을 사용하여, 이 저자는 신장과 수축의 동적 움직임을 보여주는 세포질 확장과 “오징어 같은”혈전 세포로 성숙한 둥근 메가 카요세포의 변환을 특징으로. 이 팔은 팔을 따라 그리고 끝에서 작은 붓기와 filiform될 때까지 점진적으로 얇아집니다. 시험관 및 액체 매체에서 얻어진 이러한 전형적인 메가카요세포 신장은 고정형 골수에서 관찰된 혈소판과 일정한 유사성을 가지며, 여기서 거대 카르요퀴트는 혈중 벽으로 시누치성 벽을 통해 긴 연장을 돌출하여 혈액 순환2,3로돌출된다. 1994년 TPO의 발견 및 복제는 골수 에 기재된 것과 유사한 프로플라틀 확장을 형성할 수 있는 배양에서 메가카르요사이클을 구별할 수 있게4,5,6. 그러나, 메가카요세포 성숙은 배양 조건에서 훨씬 덜 효율적이며, 특히 골수 성숙 메가카요세포의 광범위한 내부 멤브레인 네트워크는 배양 된 메가 카요사이클로 저개발되어 혈소판 생물 발생7,8의메커니즘에 대한 연구를 방해한다.
우리는 여기에 Thiéry와 Bessis에 따라 골수 박멸 모델을 자세히 설명, 마우스 메가 카요 사이클의 실시간 proplatelet 형성에 따라, 이는 완전히 자신의 네이티브 환경에서 성숙한, 따라서 체외 유물과 오해에서 가능한 우회. 야생 형 성인 마우스에서 얻은 결과는 프로 플라틀릿, 그들의 형태 및 프로 플라츠의 복잡성을 확장하는 메가 카요사이클의 능력을 설명하기 위해 제시된다. 또한 메가카요세포 기록 과정에서 데이터 정확성과 견고성을 보장하기 위해 품질 검증을 위한 신속한 정량화 전략을 도입했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 이전에 책 장9로출판된 방법의 최신 버전입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 골수에서 성장한 프로혈소를 확장하기 위하여 거대 karyocytes의 효율성을 평가하는 간단하고 저렴한 체외 방법을 기술합니다. 마우스에 대한 골수 각질 모델은 네 가지 주요 장점이 있습니다. 첫째, 고급 기술 기술이 필요하지 않습니다. 둘째, 메가카요세포-연장 프로플라틀을 얻는 데 필요한 시간은 매우 짧고, 절제 방법에 대해서만 6시간밖에 되지 않는데, 이는 마우스 전?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 장 이브 린켈, 줄리 보셔, 패트리샤 래퍼, 모니크 프룬드, 케티 크네즈-히퍼트에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ANR (기관 국가 드 라 Recherche) 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01 및 ANR-18-CE14-0037에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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