Dinâmica de formação de propulato de plantas de medula óssea fresca
Summary
Aqui, detalhamos o método de explanta da medula óssea, desde a preparação da amostra até a análise de slides microscópicas, para avaliar a capacidade de megacaiócitos que se diferenciaram em seu ambiente fisiológico para formar proplatelets.
Abstract
A última etapa da megacaripoiese leva a extensões citoplasmáticas de megacaiócitos maduros, os chamados proplatelets. Muito se tem aprendido sobre a formação proplatelet usando megacariócitos in vitro-diferenciados; no entanto, há uma evidência crescente de que os sistemas de cultura convencionais não recapitulem fielmente o processo de diferenciação/maturação que ocorre dentro da medula óssea. Neste manuscrito, apresentamos um método de explanta inicialmente descrito em 1956 por Thiéry e Bessis para visualizar megacaiócitos que amadureceram em seu ambiente nativo, contornando assim artefatos potenciais e interpretações erradas. As medulas ósseas frescas são coletadas lavando os fêmures de camundongos, fatiadas em seções transversais de 0,5 mm e colocadas em uma câmara de incubação a 37 °C contendo um tampão fisiológico. Megacariócitos tornam-se gradualmente visíveis na periferia explant e são observados até 6 horas sob um microscópio invertido acoplado a uma câmera de vídeo. Com o tempo, os megacaiócitos mudam de forma, com algumas células tendo uma forma esférica e outras desenvolvendo extensões grossas ou estendendo muitas proplatelets finas com ramificações extensas. Tanto investigações qualitativas quanto quantitativas são realizadas. Este método tem a vantagem de ser simples, reproduzível e rápido, pois numerosos megacaiócitos estão presentes, e classicamente metade deles forma proplatelets em 6 horas em comparação com 4 dias para megacariócitos de camundongos cultivados. Além do estudo de camundongos mutantes, uma aplicação interessante desse método é a avaliação direta dos agentes farmacológicos no processo de extensão proplatelet, sem interferir no processo de diferenciação que pode ocorrer nas culturas.
Introduction
A técnica de explant de medula óssea foi desenvolvida pela primeira vez por Thiéry e Bessis em 1956 para descrever a formação de extensões citoplasmáticas de megacariote de ratos como um evento inicial na formação de plaquetas1. Utilizando o contraste de fase e técnicas cinematográficas, esses autores caracterizaram a transformação de megacaiócitos redondos maduros em células trombocitopegênicas “semelhantes a lulas” com extensões citoplasmáticas mostrando movimentos dinâmicos de alongamento e contração. Estes braços ficam progressivamente mais finos até ficarem filiformes com pequenos inchaços ao longo dos braços e nas pontas. Estes alongamentos típicos de megacaiócitos, obtidos in vitro e em mídia líquida, têm certas semelhanças com plaquetas observadas em medula óssea fixa, onde megacariócitos se projetam extensões longas através das paredes sinusoides na circulação sanguínea2,3. A descoberta e clonagem de TPO em 1994 permitiu diferenciar megacariócitos na cultura capaz de formar extensões proplateletas semelhantes às descritas nas explantas de medula óssea4,5,6. No entanto, o amadurecimento do megacaito é muito menos eficiente em condições culturais, notadamente a extensa rede interna de membrana de megacariócitos amadurecidos de medula óssea é subdesenvolvida em megacaiócitos cultivados, dificultando estudos sobre os mecanismos da biogênese plaqueta7,8.
Detalhamos aqui o modelo de explante de medula óssea, baseado em Thiéry e Bessis, para seguir em formação proplatelet em tempo real de megacariócitos de camundongos, que amadureceram totalmente em seu ambiente nativo, contornando assim possíveis artefatos in vitro e interpretações erradas. Os resultados obtidos em camundongos adultos do tipo selvagem são apresentados para ilustrar a capacidade do megacariote de estender proplatelets, sua morfologia e a complexidade dos proplatelets. Também introduzimos uma estratégia de quantificação rápida para validação da qualidade para garantir a precisão e robustez dos dados durante o processo de gravação de megacariote. O protocolo aqui apresentado é a versão mais recente do método publicado como um capítulo de livro anteriormente9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui descrevemos um método in vitro simples e de baixo custo para avaliar a eficiência dos megacaiócitos para estender proplatelets que cresceram na medula óssea. O modelo de explant de medula óssea para mouse tem quatro principais vantagens. Primeiro, não são necessárias habilidades técnicas avançadas. Em segundo lugar, o tempo necessário para obter proplatelets de prolatos de extensão de megacaito é bastante curto, apenas 6 horas para o método de explant, em comparação com um mínimo de 4 dias …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer a Jean-Yves Rinckel, Julie Boscher, Patricia Laeuffer, Monique Freund, Ketty Knez-Hippert pela assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela ANR (Agence National de la Recherche) Grant ANR-17-CE14-0001-01 e ANR-18-CE14-0037.
Materials
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| CaCl2.6H2O | Sigma | 21108 | |
| Coverwall Incubation Chambers | Electron Microscopy Sciences | 70324-02 | Depth : 0,2 mm |
| HEPES | Sigma | H-3375 | pH adjusted to 7.5 |
| Human serum albumin | VIALEBEX | authorized medication : n° 3400956446995 | 20% (200mg/mL -100mL) |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| MgCl2.6H2O | Sigma | BVBW8448 | |
| Micro Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72200-40 | 22 mm x 55 mm |
| Microscope | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | DMI8 – 514341 | air lens |
| microscope camera | Leica Microsystems SA, Westlar, Germany | K5 CMS GmbH -14401137 | image resolution : 4.2 megapixel |
| Mouse serum | BioWest | S2160-010 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Razor blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | |
| Sucrose D (+) | Sigma | G8270 |
References
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