تهدف هذه الورقة إلى توفير بروتوكول لعزل وثقافة الخلايا الليفية الأولية المرتبطة بالسرطان من نموذج مورين سينجيني لسرطان الثدي ثلاثي السلبية وتطبيقها للدراسة قبل السريرية للجسيمات النانوية الجديدة المصممة لاستهداف البيئة الدقيقة للورم.
الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) هي الجهات الفاعلة الرئيسية في سياق البيئة الدقيقة للورم. على الرغم من انخفاض عددها بالمقارنة مع الخلايا السرطانية ، فإن CAFs تنظم تطور الورم وتوفر الحماية من مناعة مضادة للورم. تهدف استراتيجيات مضادات السرطان الناشئة إلى إعادة تشكيل البيئة الدقيقة للورم من خلال استئصال CAFs المؤيدة للورم أو إعادة برمجة وظائف CAFs وحالة تنشيطها. ومن النهج الواعدة تطوير عوامل توصيل نانوية الحجم قادرة على استهداف ال CAFs، مما يسمح بتوصيل الأدوية والجزيئات النشطة على وجه التحديد. وفي هذا السياق، قد يوفر النموذج الخلوي لصناديق الخلايا المكيالة أداة مفيدة للفحص المختبري والتحقيق الأولي في هذه الأشكال النانوية.
تصف هذه الدراسة عزلة وثقافة CAFs الأولية من نموذج مورين 4T1 syngeneic لسرطان الثدي الثلاثي السلبي. استخدمت الخرز المغناطيسي في عملية فصل من خطوتين لاستخراج CAFs من الأورام المفككة. تم إجراء التحكم في الفينوتيبينج المناعي باستخدام قياس التدفق الخلوي بعد كل مقطع للتحقق من عائد العملية. يمكن استخدام CAFs المعزولة لدراسة القدرة على استهداف الأشكال النانوية المختلفة المصممة لمعالجة البيئة الدقيقة للورم. تم استخدام الجسيمات النانوية H-ferritin المسماة بالفلورسنت كجسيمات نانوية مرشحة لإعداد الطريقة. تم تحليل الجسيمات النانوية ، إما عارية أو مترافقة مع ليغاند الاستهداف ، لربطها ب CAFs. تشير النتائج إلى أن استخراج الجسم الحي السابق من CAFs الثدي قد يكون نظاما مفيدا لاختبار والتحقق من صحة الجسيمات النانوية لاستهداف محدد من CAFs tumorigenic.
خلال العقود الماضية ، أصبح من الواضح أن قتل الخلايا السرطانية عادة ما لا يكفي للقضاء على الأورام الخبيثة ، حيث أن البيئة الدقيقة للورم قد تدفع إلى انتكاس الورم وتحفز المقاومة العلاجية1،2. ثم ظهر نموذج جديد: استهداف الورم ستروما لحرمان الورم من العوامل الداعمة وبالتالي، تعزيز فعالية العلاج الكيميائي3،4،5. على وجه الخصوص، الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (CAFs) هي هدف سترومال مثيرة للاهتمام في العديد من الأورام الصلبة6،7. CAFs هي مجموعة غير متجانسة جدا من الخلايا التي تتفاعل مع الخلايا السرطانية وخلايا الجهاز المناعي من خلال إفراز عوامل النمو والسيتوكينات والكيموكينات. بناء وإعادة تشكيل مصفوفة خارج الخلية؛ وتمكين تشكيل الانبثاث8،9،10،11،12. اعتمادا على نوع الورم، تظهر CAFs وظائف مؤيدة للورم، في حين أن الأنواع الفرعية الأخرى من CAFs يبدو أن لديها وظائف قمع الورم13،14. لتوضيح هذا الانقسام بشكل أفضل ، من المهم توصيف شامل ل CAFs من الأورام الأولية والمنقشورية.
في هذا السياق، ركز مجال أبحاث ناشئ على تطوير عوامل نانوية مصممة لاستهداف و/أو تدمير CAFs من خلال تقديم جزيئات وأدوية نشطة قادرة على إعادة تشكيل البيئة الدقيقة للورم15و16و17و18. وقد تم تصميم عدة أنواع من الجسيمات النانوية لتحقيق الاستئصال CAF عن طريق الأدوية السامة للخلايا, للحث على العلاج الديناميكي الضوئي CAF المستهدفة, أو لإعادة برمجة CAFs عن طريق إعادتها إلى حالة هادئة أو حث TNF ذات الصلة المبرمج الناجم عن تعبير ليغاند, الذي يحفز موت الخلايا السرطانية المجاورة16,19. وعلاوة على ذلك، فإن قدرة العديد من الجسيمات النانوية على استهداف علامات بيولوجية محددة بنشاط تثير الأمل في اختيار مجموعات فرعية من ال CAF لاستهدافها. على الرغم من أن خصوصية مطلقة ل CAF لا يزال موضع تساؤل, بروتين تنشيط الخلايا الليفية (FAP) هي واحدة من الأهداف الواعدة من ستروما الموالية tumorigenic ويتم استغلالها لتوجيه تسليم المخدرات النانوية, مما يمهد الطريق لتطوير العلاج النانوي CAF استهداف20,21,22.
تصف هذه الورقة عزل CAFs الأولية من نموذج سينجيني لسرطان الثدي مورين وتقارير استخدامها في دراسة القدرة على استهداف الجسيمات النانوية المهندسة للتعرف على علامة CAF، FAP. وتستخدم الكواجس النانوية فيريتين كأنظمة نانوية مرشحة لإعداد هذه الطريقة، كما قد تتشكل خصوصية التسليم من قبل التعرض السطحي لاستهداف moieties23،24. وعلاوة على ذلك، ثبت بنجاح فيريتينس أن تكون ممتازة مكوكات متوافقة بيولوجيا لتطبيقات مضادة للورم، مما أدى إلى تراكم سريع للحمولة في كتلة الورم25،26،27. حتى الآن، وقد شاركت الدراسات قبل السريرية من أنظمة النانو CAF استهداف في المختبر اختبار على خطوط الخلايا الليفية حفز في الثقافة مع تحويل عامل النمو بيتا للحث على تنشيط الخلية والتعبير عن بعض الميزات المناعية من CAFs28،29. عادة ما يتم تطبيق هذه الطريقة على خطوط الخلايا الخالدة (مثل NIH3T3، LX-2) وسريعة وبسيطة جدا، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا في غضون ساعات أو أيام قليلة. وهناك قيود على أنه على الرغم من التحفيز في المختبر يحفز التعبير عن بعض الجينات المنسوبة إلى الخلايا الميوفيبروبلاست المنشطة، فإنه لا يمكن تلخيص تماما جميع السمات البيولوجية من CAFs الحقيقي، وخاصة عدم التجانس في الجسم الحي.
استراتيجية أخرى تنطوي على استخراج CAFs الأولية من عينات ورم الإنسان أو الماوس30،31. وهذا يضمن أن يحدث تنشيط CAF في سياق فسيولوجي، وأنه يتم الحفاظ على عدم التجانس من الخلايا الفرعية CAF. ووفقا لهدف البحث، يمكن أن تستمد الصناديق الاستئمانية المعتمدة من مصادر مختلفة، مما يتيح إمكانية دراسة الحالة الأكثر موثوقية. البروتوكول المبلغ عنه هنا سيكون ذا قيمة للعلماء الذين يسعون إلى إجراء تقييم أولي لوظائف الجسيمات النانوية الجديدة المصممة لاستهداف CAFs من نموذج سرطان الثدي مورين. CAFs معزولة ستكون مفيدة لفحص تلك الجسيمات النانوية التي تعد بما فيه الكفاية للمضي قدما في تقييم الجسم الحي في النماذج الحيوانية للسرطان. وسيكون ذلك ذا صلة خلال الخطوات الأولى لإنتاج الجسيمات النانوية، مما يدفع علماء التكنولوجيا النانوية نحو تحسين تصميم الجسيمات النانوية من خلال النظر بشكل رئيسي في استراتيجية شل حركة الليغند لتحقيق خصائص الاستهداف المثلى.
تظهر CAFs كلاعبين رئيسيين في إعادة عرض المصفوفة خارج الخلية ، وتعزيز تطور الانبثاث ، والحد من الوصول إلى الدواء إلى موقع الورم34. ومع ذلك ، نظرا تجانسها ، لا تزال أدوارها مثيرة للجدل – بعض CAFs هي الأورام ، في حين يبدو أن بعض الأنواع الفرعية الأخرى لها دور قمع الورم. في هذا السياق، يمكن عزلتهم تكون ذات أهمية قصوى لتسليط المزيد من الضوء على دورها الكثير من الجدل في تطور السرطان، والتي سيكون لها آثار سريرية هامة12،31. وعلاوة على ذلك، فإن الاستخراج الناجح ل CAF من نماذج ورم الفأر البشرية وقبل السريرية من شأنه أيضا أن يسهل تطوير أدوية جديدة تستهدف CAF. هذه الورقة تقارير طريقة لعزل بكفاءة والثقافة CAFs الأولية من نموذج ما قبل السريرية syngeneic من سرطان الثدي. واستنادا إلى الخبرة، تؤثر ثلاث خطوات تجريبية في الغالب على نجاح البروتوكول.
الأول يعمل بسرعة لتجنب تجميع تعليق الخلايا المرتبطة بخطر التخثر في العمود وإبطاء ارتجاع الخلايا: في الواقع، عندما تم تجميع الخلايا التي مرت عبر العمود معا، زاد احتمال حدوث عملية عزل دون المستوى الأمثل، واحتوت الثقافات النهائية على استنساخ خلايا “ملوثة”. والثاني هو تجميع الخلايا من أورام مختلفة بعد مرور الاستنفاد لضمان ما يكفي من الخلايا لتمريرها في خطوة الإثراء النهائية. القضية الحرجة الأخيرة هي طلاء الخلايا المستخرجة بكثافات خلايا عالية ، على الأرجح بدءا من بئر واحد من لوحة 24 بئرا لتعزيز نمو الخلايا وتوسع المستعمرة لمدة تصل إلى 4-5 مقاطع. إذا كانت الخلايا بذر في كثافات منخفضة، فإنها توسعت على السطح الحر وتوقفت بسرعة تكرار.
وقد وصفت العديد من الدراسات بالفعل أساليب استخراج CAF من أصل الإنسان والفأر على حد سواء، لدراسة دورها في تعزيز تطور السرطان والتوغل. وقد تم ذلك في العديد من أنواع الأورام, بما في ذلك سرطان الثدي, سرطان الجلد, سرطان الأوعية الدموية, وسرطان الغدة ال غدي البنكرياس35,36,37,38. ومع ذلك ، بسبب عدم وجود علامات CAF محددة وعدم تجانسها ، لا تزال نتائج هذه العمليات دون المستوى الأمثل.
هنا، تم استخدام الخلايا المعزولة للتحقق من صحة قدرة استهداف CAF من الكعك النانوي HFn وظيفية مع مكافحة FAP استهداف moieties. كان استخدام الثقافات الأولية ل CAFs ميزة كبيرة ، مما سمح بالتحقق من صحة النانوستراتيجي ex vivo بتجربة ربط أبسط بكثير وفعالة من حيث التكلفة من القيام بذلك مباشرة في الجسم الحي في هذه المرحلة الأولية من تحسين المخدرات النانوية.
وبهذا المعنى، يمكن أن يسبق اختبار الجسم الحي السابق على CAFs في التجارب الحيوانية الحية من خلال السماح بفحص واختيار الجسيمات النانوية الواعدة للاستهداف الأمثل ل CAF. يمكن أيضا استخدام نموذج CAF المعروض هنا لدراسات الفعالية الأولية ، عند تحميل الجسيمات النانوية بالأدوية النشطة. سيتم استخدام الحيوانات في وقت لاحق فقط لتقييم التوزيع الحيوي ، وعلم الصيدلة ، ودراسات الفعالية.
ويجري تطوير العديد من العقاقير النانوية التي تستهدف CAF، مثل الكوابير النانوية فيريتين للعلاج الضوئي في سرطان الثدي والجسيمات القائمة على الببتيد لتقديم الدوكسوروبيسين في نماذج سرطان البروستاتا39،40. ومع ذلك ، لم تركز العديد من الدراسات على عزل CAFs كمنصات للخلايا لتحسين المخدرات النانوية.
هذا البروتوكول له بعض القيود. أولا، إنه بروتوكول يستغرق وقتا طويلا، ويتطلب إعداد وشراء العديد من الكواشف والمواد. ثانيا، نظرا لندرة CAFs في ورم الثدي 4T1، غلتها منخفضة. وينبغي التخطيط لتجارب الجسيمات النانوية وتنفيذها بمجرد تحقيق رقم الخلية المطلوب، حيث تخضع الخلايا الكافورة الأولية للانارة ولا يمكن الحفاظ عليها في الثقافة لفترة طويلة. في الختام، يمكن أن تكون هذه الطريقة لعزل وزراعة وتوصيف CAFs أداة قوية لتسريع تطوير أدوية نانوية مستهدفة جديدة في مكافحة السرطان.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذه الدراسة من قبل Associazione Italiana لكل لا Ricerca sul Cancro (AIRC) بموجب مشروع IG 2017-ID. 20172 – P.I. Corsi Fabio. SM تعترف مركز البحوث السريرية للأطفال “روميو وإنريكا Invernizzi” التي تدعم موقفها. AB تشكر AIRC (مشروع ID. 20172) وجامعة ميلانو على زمالة البحث. زمالات ما بعد الدكتوراه والدكتوراه في جامعة ميلانو تدعمها.
ACK Lysing buffer | Lonza | 10-548E | Store at +15° to +30 °C. |
Alexa Fluor 488 goat anti-human antibody | Immunological Science | IS-20022 | Protect from light. |
Anti-FAP Fab fragment (3F2) | Creative Biolabs | TAB-024WM-F(E) | |
BALB/c mice | Charles River | 028BALB/C | 7 weeks old female mice |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | Store at 2-8 °C. |
CD45 antibody | Miltenyi Biotec | 130-110-796 | FITC-conjugated fluorescent antibody; clone REA 737; Store protected from light at 2–8 °C. |
CD90.2 antibody | Miltenyi Biotec | 130-102-960 | PE-conjugated fluorescent antibody; clone 30-H12; Store protected from light at 2–8 °C. |
Cell strainers 70 µm | VWR | 732-2758 | |
CytoFLEX | Beckman Coulter | laser configuration B4-R2-V0 | |
Dead cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | contains 10 mL of Dead Cell Removal MicroBeads; 25 mL of 20× Binding Buffer Stock Solution. Store protected from light at 2−8 °C. |
D-Luciferin | Caliper | 760504 | reagent for in vivo imaging |
DMEM High Glucose w/o L-Glutamine w/ Sodium Pyruvate | Euroclone | ECB7501L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DPBS w/o Calcium, w/o Magnesium | Euroclone | ECB4004L | Keep at room temperature. |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Fetal Bovine Serum | Euroclone | ECS0180L | Before use, heat at 56 °C for 30 min to kill all the complement proteins. |
Fluorescein Istothiocyanate isomer I (FITC) | Sigma-Aldrich | F7250 | Store protected from light at 2–8 °C. |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | They are used in combination with the gentleMACS Dissociator. |
GentleMACS dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Two samples can be processed in parallel. Special protocols have been developed for various tissues. |
Goat serum | Euroclone | ECS0200D | |
Ham's F12 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB7502L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
IVIS Lumina II imaging system | Caliper Life Sciences | This imaging system is easy to use for both fluorescent and bioluminescent imaging in vivo. Equipped with a Living Image Software for analysis | |
LD columns | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for stringent depletion of unwanted cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use |
L-Glutamine | Euroclone | ECB3000D | 200 mM stock |
Light/fluorescence microscope equipped with camera | Leica Microsystems | DM IL LED Fluo/ ICC50 W CameraModule | inverted microscope for live cells with camera |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
MACS Separation Unit | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | Position the magnet on appropriate stand before use. |
MACS Tissue Storage Solution | Miltenyi Biotec | 130-100-008 | |
MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | Composed of ferromagnetic spheres, designed for positive selection of cells. Position the required number of columns on the magnetic Separation Unit and equilibrate with buffer before use. |
Mycoplasma Removal Agent | Euroclone | ECMC210A | Dilute in culture medium 1:100. |
NaHCO3 | Invitrogen | A10235 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000C | |
Non essential aminoacids | Euroclone | ECB3054D | |
Penicillin-Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
Recombinant Human apoferritin H-homopolymer (HFn) | Molirom | MLR-P018 | |
RPMI 1640 w/o L-Glutamine | Euroclone | ECB9006L | Warm at 37 °C in a water bath before use. |
Tumor-Associated Fibroblast Isolation kit | Miltenyi Biotec | 130-116-474 | Contains 1 mL of Non-Tumor-Associated Fibroblast Depletion Cocktail, mouse; 1 mL of CD90.2 (Tumor-Associated Fibroblast) MicroBeads,mouse. Store protected from light at 2-8 °C. |
Tumor Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | Contains lyophilized enzymes (D, R, A) and buffer A; reconstitute enzymes according to the manufacturer's instructions, aliquot and store at – 20 °C. |
Trypan blue 0.4% | Lonza | 17-942E | dilute 1:1 with a sample of cell suspension before counting the cells |
TrypLE select | Gibco | 12563-029 | use at room temperature |
Trypsin-EDTA | Lonza | BE17-161E | Warm at 37 °C in a water bath before use |
T75 Primo TC flask | Euroclone | ET7076 | |
Zeba Spin Desalting Columns | Thermo Fisher Scientific | 89890 | 7K MWCO, 2 mL |
1.5 mL tubes | Biosigma | CL15.002.0500 | |
15 mL tubes | Euroclone | ET5015B | |
4T1-luc2 | Caliper | Mouse mammary gland cancer cell line stably transfected with firefly luciferase gene | |
50 mL tubes | Euroclone | ET5050B |