Megakaryocyt Kultur i 3D Methylcellulose-baserede Hydrogel at forbedre cellemodning og studere virkningen af stivhed og indespærring
Summary
Det er nu anerkendt, at de tre-dimensionelle miljø af celler kan spille en vigtig rolle i deres adfærd, modning og / eller differentiering. Denne protokol beskriver en tredimensionel cellekulturmodel designet til at studere virkningen af fysisk indeslutning og mekaniske begrænsninger på megakaryocytter.
Abstract
3D-miljøet, der fører til både indespærring og mekaniske begrænsninger, anerkendes i stigende grad som en vigtig faktor for celleadfærd. 3D-kulturen er således blevet udviklet for bedre at kunne nærme sig in vivo-situationen. Megakaryocytter skelner fra hæmatoopoietiske stamceller og stamfaderceller (HSPCs) i knoglemarven (BM). BM er en af de blødeste væv i kroppen, indespærret inde i knoglen. Knoglen er dårligt udvides på celleskalaen, megakaryocytter er samtidig udsat for en svag stivhed og høj indespærring. Denne protokol præsenterer en metode til inddrivelse af museperage negative (Lin-) HSPCs ved immunmagnetisk sortering og deres differentiering i modne megakaryocytter i et 3D-medium bestående af methylcellulose. Methylcellulose er ikke reaktivt over for megakaryocytter, og dens stivhed kan justeres til den normale knoglemarv eller øges for at efterligne en patologisk fibrotisk marv. Processen med at gendanne megakaryocytterne til yderligere celleanalyser er også beskrevet i protokollen. Selvom proplateletforlængelse forhindres i 3D-miljøet, er det beskrevet nedenfor, hvordan man genanvender megakaryocytterne i flydende medium og kvantificerer deres evne til at udvide proplatelets. Megakaryocytter dyrket i 3D hydrogel har en højere kapacitet til at danne proplatelets sammenlignet med dem, der dyrkes i et flydende miljø. Denne 3D-kultur gør det muligt i) at differentiere forfædre mod megakaryocytter nå en højere modning tilstand, ii) at generobre fænotyper, der kan observeres in vivo, men gå ubemærket hen i klassiske flydende kulturer, og iii) at studere transduktion veje induceret af de mekaniske signaler, som en 3D-miljø.
Introduction
Celler i kroppen oplever et komplekst 3D-mikromiljø og udsættes for samspillet mellem kemiske og mekanofysiske signaler, herunder stivhed fra væv og indespærring på grund af tilstødende celler og omgivende matrix 1,2,3. Betydningen af stivhed og indespærring for celle adfærd er kun blevet anerkendt i de sidste årtier. I 2006 fremhævede det skelsættende værk fra Engler et al. 4 betydningen af det mekaniske miljø for celledifferentiering. Forfatterne viste, at variation i cellesubstrat stivhed resulterede i orientering af stamceller mod forskellige differentiering slægter. Siden da er virkningen af mekaniske signaler på celle skæbne og adfærd blevet mere og mere anerkendt og studeret. På trods af at det er et af organismens blødeste væv, har knoglemarven en 3D strukturel organisation, der er indespærret inde i knoglen. Marv stivhed, selv om teknisk vanskeligt at måle præcist, skønnes at ligge mellem 15 og 300 Pa 5,6. Inden for stroma, celler er tæt begrænset til hinanden. Derudover migrerer de fleste af dem mod bihulekarrene for at komme ind i blodcirkulationen. Disse betingelser skaber yderligere mekaniske begrænsninger på tilstødende celler, som skal tilpasse sig disse kræfter. Mekaniske signaler repræsenterer et vigtigt parameter, hvis konsekvenser for megakaryocyt differentiering og proplatelet dannelse er for nylig blevet undersøgt. Selvom megakaryocytter kan differentiere in vitro i traditionel flydende kultur, når de ikke den grad af modning observeret in vivo, til dels på grund af fraværet af de mekaniske signaler fra 3D-miljøet 7. Voksende forfædre indlejret i hydrogel bringer 3D mekaniske signaler, der mangler i flydende miljø.
Hydrogels har været meget udbredt i flere årtier i det hæmatologiske område, især at dyrke celler i koloni danner assays at kvantificere hæmatopoietic forfædre. Sådanne hydrogeler er imidlertid sjældent blevet brugt til at udforske de biologiske virkninger af det 3D mekaniske miljø på modning og differentiering af hæmatoopoietiske celler. I løbet af de sidste par år har vores laboratorium udviklet en 3D-kulturmodel ved hjælp af en methylcellulosebaseret hydrogel 8. Denne ikke-aktive fysiske gel er et nyttigt værktøj til at efterligne de fysiske begrænsninger i det indfødte megakaryocytmiljø. Den er afledt af cellulose ved udskiftning af hydroxylrester (-OH) med methoxidgrupper (-OCH3). Både graden af methylsubstitution og methylcellulosekoncentrationen bestemmer hydrogelstivheden, når den har jellified. Under udviklingsfasen af denne teknik blev det påvist, at en Youngs modulus i intervallet 30 til 60 Pa er den optimale gelstivhed til megakaryocytvækst 9.
Følgende protokol beskriver en metode til at dyrke mus megakaryocytiske forfædre i en 3D methylcellulose hydrogel. Det har tidligere vist sig, at sammenlignet med standard flydende kultur øger denne hydrogelkultur graden af megakaryocyt polyploidisering, forbedrer modningen og intracellulær organisation og øger megakaryocytternes kapacitet til at udvide proplatelets, når de er suspenderet igen i et flydende medium 9. Dette manuskript beskriver i detaljer protokollen for isolering af musebenmarv Lin- celler og deres indlejring i en methylcellulose hydrogel til 3D-kultur samt kvantificeringen af deres evne til at producere proplatelets og inddrivelse af cellerne til yderligere analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det foregående årti har mekanobiologi rejst mere og mere interesse for mange områder af biologi. Det er nu almindeligt anerkendt, at det mekaniske miljø omkring cellerne spiller en rolle i deres adfærd, understreger vigtigheden af at studere, hvordan megakaryocytter forstand og reagere på ekstracellulære mekaniske signaler. Det er udfordrende præcist at måle stivheden af knoglemarvsvævet in situ11, især hvis vi betragter den hæmatopoietiske røde marv, da den er placeret ind…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Fabien Pertuy og Alicia Aguilar, der oprindeligt udviklede denne teknik i laboratoriet, samt Dominique Collin (Institut Charles Sadron – Strasbourg), der karakteriserede de viskoelastic egenskaber af methylcellulose hydrogel. Dette arbejde blev støttet af ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) og af et ARN-tilskud (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher er modtager af Fondation pour la Recherche Médicale (FRM-tilskudsnummer FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
