Megakaryocyttkultur i 3D Methylcellulose-basert hydrogel for å forbedre cellemodning og studere virkningen av stivhet og innesperring
Summary
Det er nå anerkjent at det tredimensjonale cellemiljøet kan spille en viktig rolle i deres oppførsel, modning og / eller differensiering. Denne protokollen beskriver en tredimensjonal cellekulturmodell designet for å studere virkningen av fysisk inneslutning og mekaniske begrensninger på megakaryocytter.
Abstract
3D-miljøet som fører til både innesperring og mekaniske begrensninger, blir i økende grad anerkjent som en viktig determinant for celleadferd. 3D-kultur er dermed utviklet for å bedre nærme seg in vivo-situasjonen. Megakaryocytter skiller seg fra hematopoietiske stamme- og stamceller (HSPCer) i benmargen (BM). BM er et av de mykeste vevene i kroppen, begrenset inne i beinet. Beinet er dårlig utvidbart i celleskalaen, megakaryocytter blir samtidig utsatt for en svak stivhet og høy innesperring. Denne protokollen presenterer en metode for gjenoppretting av mus avledning negative (Lin-) HSPCer ved immuno-magnetisk sortering og deres differensiering i modne megakaryocytter i et 3D-medium sammensatt av metylcellulose. Metylcellulose er ikke-reaktiv mot megakaryocytter, og stivheten kan justeres til normal benmarg eller økes for å etterligne en patologisk fibrotisk marg. Prosessen for å gjenopprette megakaryocyttene for videre celleanalyser er også detaljert i protokollen. Selv om proplateletforlengelse er forhindret i 3D-miljøet, er det beskrevet nedenfor hvordan du resuspenderer megakaryocyttene i flytende medium og for å kvantifisere deres evne til å forlenge proplatelets. Megakaryocytter dyrket i 3D hydrogel har høyere kapasitet til å danne proplater sammenlignet med de som vokser i et flytende miljø. Denne 3D-kulturen tillater i) å skille forfedre mot megakaryocytter som når en høyere modningstilstand, ii) for å rekapitulere fenotyper som kan observeres in vivo, men gå ubemerket i klassiske flytende kulturer, og iii) for å studere transduksjonsveier indusert av de mekaniske signalene som tilbys av et 3D-miljø.
Introduction
Celler i kroppen opplever et komplekst 3D-mikromiljø og blir utsatt for samspillet mellom kjemiske og mekanofysiske signaler, inkludert stivhet fra vevet og innesperring på grunn av nærliggende celler og omkringliggende matrise 1,2,3. Betydningen av stivhet og innesperring for celleadferd har bare blitt anerkjent de siste tiårene. I 2006 fremhevet det banebrytende arbeidet fra Engler et al. 4 viktigheten av det mekaniske miljøet for celledifferensiering. Forfatterne viste at variasjon i cellesubstratstivhet resulterte i orientering av stamceller mot ulike differensieringslinjer. Siden da har virkningen av mekaniske signaler på celle skjebne og oppførsel blitt stadig mer anerkjent og studert. Til tross for at det er et av organismens mykeste vev, har benmargen en 3D-strukturell organisasjon som er begrenset inne i beinet. Margstivhet, selv om det er teknisk vanskelig å måle nøyaktig, anslås å ligge mellom 15 og 300 Pa 5,6. Innenfor stromaen er cellene tett begrenset til hverandre. I tillegg migrerer de fleste av dem mot sinusoidkarene for å komme inn i blodsirkulasjonen. Disse forholdene skaper ytterligere mekaniske begrensninger på tilstøtende celler, som må tilpasse seg disse kreftene. Mekaniske signaler representerer en viktig parameter hvis konsekvenser på megakaryocyttdifferensiering og proplateletformasjon nylig har blitt utforsket. Selv om megakaryocytter kan skille in vitro i tradisjonell flytende kultur, når de ikke graden av modning observert in vivo, delvis på grunn av fraværet av de mekaniske signalene fra 3D-miljøet 7. Voksende forfedre innebygd i hydrogel bringer 3D mekaniske signaler som mangler i flytende miljø.
Hydrogeler har vært mye brukt i flere tiår i det hematologiske feltet, spesielt for å dyrke celler i koloni som danner analyser for å kvantifisere hematopoietiske forfedre. Imidlertid har slike hydrogeler sjelden blitt brukt til å utforske den biologiske effekten av det 3D-mekaniske miljøet på modning og differensiering av hematopoietiske celler. I løpet av de siste årene har vårt laboratorium utviklet en 3D-kulturmodell ved hjelp av en metylcellulosebasert hydrogel 8. Denne ikke-interaktive fysiske gelen er et nyttig verktøy for å etterligne de fysiske begrensningene i det opprinnelige megakaryocyttmiljøet. Den er avledet fra cellulose ved utskifting av hydroksylrester (-OH) av metoksydgrupper (-OCH3). Både graden av metylerstatning og metylcellulosekonsentrasjonen bestemmer hydrogelstivheten når den har geleidet. Under utviklingsstadiet av denne teknikken ble det demonstrert at en Youngs modulus i området 30 til 60 Pa er den optimale gelstivheten for megakaryocyttvekst 9.
Følgende protokoll beskriver en metode for å dyrke mus megakaryocytiske forfedre i en 3D metylcellulose hydrogel. Det har tidligere vist seg at sammenlignet med standard flytende kultur, øker denne hydrogelkulturen graden av megakaryocyttpolyploidisering, forbedrer modningen og intracellulær organisasjon, og øker kapasiteten til megakaryocytter for å utvide proplatelets når de er resuspendert i et flytende medium 9. Dette manuskriptet beskriver i detalj protokollen for isolering av musebenmarg Lin- celler og deres innbygging i en metylcellulosehydrgel for 3D-kultur, samt kvantifisering av deres evne til å produsere proplatelets og utvinning av cellene for videre analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I det forrige tiåret har mekanobiologi økt mer og mer interesse for mange områder av biologi. Det er nå ofte anerkjent at det mekaniske miljøet rundt cellene spiller en rolle i deres oppførsel, og understreker viktigheten av å studere hvordan megakaryocytter sanser og reagerer på ekstracellulære mekaniske signaler. Det er utfordrende å nøyaktig måle stivheten i benmargsvevet in situ11, spesielt hvis vi vurderer den hematopoietiske røde margen som den ligger inne i trabekulær…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil takke Fabien Pertuy og Alicia Aguilar som først utviklet denne teknikken i laboratoriet, samt Dominique Collin (Institut Charles Sadron – Strasbourg) som karakteriserte de viskoelastiske egenskapene til metylcellulosehydrgelen. Dette arbeidet ble støttet av ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) og av et ARN-stipend (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher er mottaker fra Fondation pour la Recherche Médicale (FRM tilskuddsnummer FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
