Cultivo de megacariocitos en hidrogel 3D a base de metilcelulosa para mejorar la maduración celular y estudiar el impacto de la rigidez y el confinamiento
Summary
Ahora se reconoce que el entorno tridimensional de las células puede desempeñar un papel importante en su comportamiento, maduración y/o diferenciación. Este protocolo describe un modelo de cultivo celular tridimensional diseñado para estudiar el impacto de la contención física y las restricciones mecánicas en los megacariocitos.
Abstract
El entorno 3D que conduce tanto al confinamiento como a las restricciones mecánicas se reconoce cada vez más como un determinante importante del comportamiento celular. Por lo tanto, el cultivo 3D se ha desarrollado para abordar mejor la situación in vivo. Los megacariocitos se diferencian de las células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) en la médula ósea (BM). El BM es uno de los tejidos más blandos del cuerpo, confinado dentro del hueso. Al ser el hueso poco extensible a escala celular, los megacariocitos están sometidos concomitantemente a una rigidez débil y un alto confinamiento. Este protocolo presenta un método para la recuperación de HSPCs de linaje de ratón negativo (Lin-) mediante clasificación inmunomagnético y su diferenciación en megacariocitos maduros en un medio 3D compuesto de metilcelulosa. La metilcelulosa no es reactiva a los megacariocitos y su rigidez puede ajustarse a la de la médula ósea normal o aumentarse para imitar una médula fibrótica patológica. El proceso para recuperar los megacariocitos para análisis celulares adicionales también se detalla en el protocolo. Aunque la extensión del proplatelet se impide dentro del entorno 3D, se describe a continuación cómo resuspendir los megacariocitos en medio líquido y cuantificar su capacidad para extender los proplatlets. Los megacariocitos cultivados en hidrogel 3D tienen una mayor capacidad para formar proplatlets en comparación con los cultivados en un entorno líquido. Este cultivo 3D permite i) diferenciar progenitores hacia megacariocitos que alcanzan un mayor estado de maduración, ii) recapitular fenotipos que pueden observarse in vivo pero que pasan desapercibidos en cultivos líquidos clásicos, y iii) estudiar vías de transducción inducidas por las señales mecánicas proporcionadas por un entorno 3D.
Introduction
Las células en el cuerpo experimentan un microambiente 3D complejo y están sujetas a la interacción entre las señales químicas y mecanofísicas, incluida la rigidez del tejido y el confinamiento debido a las células vecinas y la matriz circundante 1,2,3. La importancia de la rigidez y el confinamiento para el comportamiento celular solo se ha reconocido en las últimas décadas. En 2006, el trabajo seminal de Engler et al. 4 destacó la importancia del entorno mecánico para la diferenciación celular. Los autores demostraron que la variación en la rigidez del sustrato celular resultó en la orientación de las células madre hacia varios linajes de diferenciación. Desde entonces, el impacto de las señales mecánicas en el destino y el comportamiento celular se ha vuelto cada vez más reconocido yestudiado. A pesar de ser uno de los tejidos más blandos del organismo, la médula ósea tiene una organización estructural 3D que está confinada dentro del hueso. La rigidez de la médula, aunque técnicamente difícil de medir con precisión, se estima que se encuentra entre 15 y 300 Pa 5,6. Dentro del estroma, las células están estrechamente confinadas entre sí. Además, la mayoría de ellos están migrando hacia los vasos sinusoides para entrar en la circulación sanguínea. Estas condiciones crean restricciones mecánicas adicionales en las células adyacentes, que tienen que adaptarse a estas fuerzas. Las señales mecánicas representan un parámetro importante cuyas consecuencias sobre la diferenciación de megacariocitos y la formación de proplatlets se han explorado recientemente. Aunque los megacariocitos pueden diferenciarse in vitro en el cultivo líquido tradicional, no alcanzan el grado de maduración observado in vivo,en parte debido a la ausencia de las señales mecánicas del entorno 3D 7. El crecimiento de progenitores incrustados en hidrogel trae señales mecánicas 3D que carecen del entorno líquido.
Los hidrogeles se han utilizado ampliamente durante varias décadas en el campo hematológico, especialmente para cultivar células en ensayos de formación de colonias para cuantificar los progenitores hematopoyéticos. Sin embargo, tales hidrogeles rara vez se han utilizado para explorar el impacto biológico del entorno mecánico 3D en la maduración y diferenciación de las células hematopoyéticas. En los últimos años nuestro laboratorio ha desarrollado un modelo de cultivo 3D utilizando un hidrogel a base de metilcelulosa 8. Este gel físico no reactivo es una herramienta útil para imitar las limitaciones físicas del entorno nativo de megacariocitos. Se deriva de la celulosa mediante la sustitución de residuos de hidroxilo (-OH) por grupos metóxido (-OCH3). Tanto el grado de sustitución de metilo como la concentración de metilcelulosa determinan la rigidez del hidrogel una vez que se ha gelatinado. Durante la etapa de desarrollo de esta técnica, se demostró que un módulo de Young en el rango de 30 a 60 Pa es la rigidez óptima del gel para el crecimiento de megacariocitos 9.
El siguiente protocolo describe un método para cultivar progenitores megacariocíticos de ratón en un hidrogel de metilcelulosa 3D. Se ha demostrado previamente que en comparación con el cultivo líquido estándar, este cultivo de hidrogel aumenta el grado de poliploidización de megacariocitos, mejora la maduración y la organización intracelular, y aumenta la capacidad de los megacariocitos para extender los proplatitos una vez resuspendidos en un medio líquido 9. Este manuscrito describe en detalle el protocolo para el aislamiento de células Lin− de médula ósea de ratón y su incrustación en un hidrogel de metilcelulosa para cultivo 3D, así como la cuantificación de su capacidad para producir proplatelets y la recuperación de las células para análisis posteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la década anterior, la mecanobiología ha despertado cada vez más interés en muchas áreas de la biología. Ahora se reconoce comúnmente que el entorno mecánico que rodea a las células juega un papel en su comportamiento, enfatizando la importancia de estudiar cómo los megacariocitos detectan y responden a las señales mecánicas extracelulares. Es difícil medir con precisión la rigidez del tejido de la médula ósea in situ11,especialmente si consideramos la médula roja hema…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Fabien Pertuy y Alicia Aguilar que inicialmente desarrollaron esta técnica en el laboratorio, así como a Dominique Collin (Institut Charles Sadron – Estrasburgo) que caracterizó las propiedades viscoelásticas del hidrogel de metilcelulosa. Este trabajo fue apoyado por ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) y por una beca ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher es beneficiaria de la Fondation pour la Recherche Médicale (número de subvención FRM FDT202012010422).
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
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