Hücre Olgunlaşmasını Geliştirmek ve Sertlik ve Hapsetmenin Etkisini İncelemek için 3D Metilselüloz Bazlı Hidrojelde Megakaryosit Kültürü
Summary
Hücrelerin üç boyutlu ortamının davranışlarında, olgunlaşmalarında ve/veya farklılaşmalarında önemli bir rol oynayabileceği artık kabul ediliyor. Bu protokol, fiziksel çevreleme ve mekanik kısıtlamaların megakaryositler üzerindeki etkisini incelemek için tasarlanmış üç boyutlu bir hücre kültürü modelini açıklar.
Abstract
Hem hapsetmeye hem de mekanik kısıtlamalara yol açan 3D ortam, hücre davranışının önemli bir belirleyicisi olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. 3D kültürü böylece in vivo durumuna daha iyi yaklaşmak için geliştirilmiştir. Megakaryositler kemik iliğindeki (BM) hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC) farklılık sağlar. BM, kemiğin içinde kapalı olarak vücudun en yumuşak dokularından biridir. Kemik hücre ölçeğinde zayıf genişletilebilir, megakaryositler birlikte zayıf bir sertliğe ve yüksek hapsetmeye maruz kalır. Bu protokol, fare soyu negatif (Lin-) HSPC’lerin immün manyetik sıralama ile kurtarılması ve metilselülozdan oluşan bir 3D ortamda olgun megakaryositlere farklılaşması için bir yöntem sunar. Metilselüloz megakaryositlere karşı reaktif değildir ve sertliği normal kemik iliğine ayarlanabilir veya patolojik fibrotik iliği taklit etmek için arttırılabilir. Daha fazla hücre analizi için megakaryositleri kurtarma işlemi de protokolde ayrıntılı olarak yer uzamaktadır. Proplatelet uzantısı 3D milieu içinde önlenmiş olsa da, megakaryositlerin sıvı ortamda nasıl yeniden sulandırılacağı ve proplateletleri uzatma kapasitelerinin nasıl ölçülmesi aşağıda açıklanmıştır. 3D hidrojelde yetişen megakaryositler, sıvı bir milieu’da yetişenlere kıyasla proplatlet oluşturma kapasitesi daha yüksektir. Bu 3B kültür, i) ataları daha yüksek olgunlaşma durumuna ulaşan megakaryositlere doğru ayırt etmeye, ii) in vivo olarak gözlemlenebilen ancak klasik sıvı kültürlerinde fark edilmeyen fenotipleri yeniden toplamaya ve iii) 3D bir ortamın sağladığı mekanik ipuçlarının neden olduğu transdüksiyon yollarını incelemeye izin verir.
Introduction
Vücuttaki hücreler karmaşık bir 3D mikroçevrimi yaşarlar ve komşu hücreler ve çevresindeki matris 1,2,3nedeniyle dokudan sertlik ve hapsetme de dahil olmak üzere kimyasal ve mekanofizik ipuçları arasındaki etkileşime tabi tutulurlar. Sertlik ve hapsetmenin hücre davranışı için önemi sadece son yıllarda kabul edilmiştir. 2006 yılında, Engler ve ark. 4’ün ufuk açıcı çalışması, mekanik ortamın hücre farklılaşması için önemini vurgulamıştır. Yazarlar, hücre substrat sertliğindeki varyasyonun kök hücrelerin çeşitli farklılaşma soylarına doğru yönlendirilmesinde neden olduğunu göstermiştir. O zamandan beri, mekanik ipuçlarının hücre kaderi ve davranışı üzerindeki etkisi giderek daha fazla tanındı ve incelendi. Organizmanın en yumuşak dokularından biri olmasına rağmen, kemik iliği kemiğin içinde sınırlı olan 3D yapısal bir organizasyona sahiptir. İlik sertliği, teknik olarak tam olarak ölçülmek zor olsa da, 15 ila 300 Pa 5,6arasında olduğu tahmin edilmektedir. Stroma içinde, hücreler birbirine sıkıca hapsedilir. Ek olarak, çoğu kan dolaşımına girmek için sinüzoid damarlara doğru göç ediyor. Bu koşullar, bu kuvvetlere uyum sağlamak zorunda olan bitişik hücreler üzerinde ek mekanik kısıtlamalar oluşturur. Mekanik ipuçları, megakaryosit farklılaşması ve proplatlet oluşumu üzerindeki sonuçları yeni araştırılmış önemli bir parametreyi temsil eder. Megakaryositler geleneksel sıvı kültüründe in vitroyu ayırt edebilse de, kısmen3D ortamdan mekanik ipuçlarının olmaması nedeniyle vivo olarak gözlenen olgunlaşma derecesine ulaşmazlar 7. Hidrojel gömülü büyüyen progenitors sıvı milieu eksik 3D mekanik ipuçları getiriyor.
Hidrojeller, hematolojik alanda birkaç on yıldır yaygın olarak kullanılmaktadır, özellikle hematolojik progenitörleri ölçmek için kolonide test oluşturan hücreleri yetiştirmek için. Bununla birlikte, bu tür hidrojeller, 3D mekanik ortamın hematopoetik hücrelerin olgunlaşması ve farklılaşması üzerindeki biyolojik etkisini araştırmak için nadiren kullanılmıştır. Son birkaç yıldır laboratuvarımız metilselüloz bazlı bir hidrojel kullanarak bir 3D kültür modeli geliştirmiştir 8. Bu tepkisel olmayan fiziksel jel, yerel megakaryosit ortamının fiziksel kısıtlamalarını taklit etmek için yararlı bir araçtır. Selülozdan hidroksil kalıntılarının (-OH) metoksit grupları (-OCH3)ile değiştirilmesi ile elde edilir. Hem metil ikame derecesi hem de metilselüloz konsantrasyonu, jöle olduktan sonra hidrojel sertliğini belirler. Bu tekniğin gelişim aşamasında, 30 ila 60 Pa aralığındaki bir Young modülünün megakaryosit büyümesi için en uygun jel sertliği olduğu gösterilmiştir 9.
Aşağıdaki protokol, 3D metilselüloz hidrojelde fare megakaryositik atalarını yetiştirme yöntemini açıklar. Standart sıvı kültürü ile karşılaştırıldığında, bu hidrojel kültürün megakaryosit poliploidizasyon derecesini artırdığı, olgunlaşmayı ve hücre içi organizasyonu iyileştirdiği ve sıvı bir ortamda yeniden yaşamdan geçirildikten sonra yayılımları uzatmak için megakaryositlerin kapasitesini artırdığı gösterilmiştir 9. Bu makale, fare kemik iliği Lin− hücrelerinin izolasyonu ve 3D kültür için metilselüloz hidrojel içine gömülmesi protokolünü ve ayrıca proplatlet üretme kapasitelerinin nicelleştirilmesini ve daha fazla analiz için hücrelerin geri kazanımını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Önceki on yılda, mekanobiyoloji biyolojinin birçok alanına giderek daha fazla ilgi uyandırmıştır. Hücreleri çevreleyen mekanik ortamın davranışlarında rol oynadığı yaygın olarak kabul edilir ve megakaryositlerin hücre dışı mekanik ipuçlarını nasıl algıladığını ve yanıt verdiğini incelemenin önemini vurgular. Kemik iliği dokusunun sertliğini doğru bir şekilde ölçmek zordur in situ11, özellikle hematopoetik kırmızı iliği büyük memelilerde trabe…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, laboratuvarda bu tekniği geliştiren Fabien Pertuy ve Alicia Aguilar’ın yanı sıra metilselüloz hidrojelinin viskoelastik özelliklerini karakterize eden Dominique Collin’e (Institut Charles Sadron – Strazburg) teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) ve bir ARN hibesi (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics) tarafından desteklendi. Julie Boscher, Fondation pour la Recherche Médicale’den (FRM hibe numarası FDT2020120104222) bir alıcıdır.
Materials
| 18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
| 21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
| 23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
| 25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
| 4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
| 5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
| Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
| Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
| Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
| Dakopen | Dako | ||
| DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
| EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
| EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
| Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
| Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
| Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
| MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
| Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
| Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
| Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
| Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
| Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
| Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
References
- Doolin, M. T., Moriarty, R. A., Stroka, K. M. Mechanosensing of Mechanical Confinement by Mesenchymal-Like Cells. Frontiers in Physiology. 11, (2020).
- Wang, C., et al. Matrix Stiffness Modulates Patient-Derived Glioblastoma Cell Fates in Three-Dimensional Hydrogels. Tissue Engineering Part A. , (2020).
- Doyle, A. D., Yamada, K. M. Mechanosensing via cell-matrix adhesions in 3D microenvironments. Experimental Cell Research. 343 (1), 60-66 (2016).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Choi, J. S., Harley, B. A. C. The combined influence of substrate elasticity and ligand density on the viability and biophysical properties of hematopoietic stem and progenitor cells. Biomaterials. 33 (18), 4460-4468 (2012).
- Shin, J. -. W., et al. Contractile forces sustain and polarize hematopoiesis from stem and progenitor cells. Cell stem cell. 14 (1), 81-93 (2014).
- Boscher, J., Guinard, I., Eckly, A., Lanza, F., Léon, C. Blood platelet formation at a glance. Journal of cell science. 133 (20), (2020).
- Aguilar, A., Boscher, J., Pertuy, F., Gachet, C., Léon, C. Three-dimensional culture in a methylcellulose-based hydrogel to study the impact of stiffness on megakaryocyte differentiation. Methods in Molecular Biology. 1812, 139-153 (2018).
- Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128, 2022-2032 (2016).
- Hitchcock, I. S., Kaushansky, K. Thrombopoietin from beginning to end. British Journal of Haematology. 165 (2), 259-268 (2014).
- Leiva, O., Leon, C., Kah Ng, S., Mangin, P., Gachet, C., Ravid, K. The role of extracellular matrix stiffness in megakaryocyte and platelet development and function. American Journal of Hematology. 93 (3), 430-441 (2018).
- Jansen, L. E., Birch, N. P., Schiffman, J. D., Crosby, A. J., Peyton, S. R. Mechanics of intact bone marrow. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 50, 299-307 (2015).
- Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
- Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
