Fabrication d’une encre de biomatériau d’agarose incorporée de nanocellulose cristalline pour la culture de mastocytes dérivés de la moelle osseuse
Summary
Ce protocole met en évidence une méthode permettant d’évaluer rapidement la biocompatibilité d’une encre de biomatériau hydrogel composite de nanocellulose cristalline (CNC) / agarose avec des mastocytes dérivés de la moelle osseuse de souris en termes de viabilité cellulaire et d’expression phénotypique des récepteurs de surface cellulaire, Kit (CD117) et récepteur IgE à haute affinité (FcεRI).
Abstract
La bioimpression tridimensionnelle (3D) utilise des composites à base d’hydrogel (ou encres de biomatériaux) qui sont déposés dans un motif, formant un substrat sur lequel les cellules sont déposées. Étant donné que de nombreuses encres de biomatériaux peuvent être potentiellement cytotoxiques pour les cellules primaires, il est nécessaire de déterminer la biocompatibilité de ces composites d’hydrogel avant leur utilisation dans des processus coûteux d’ingénierie tissulaire 3D. Certaines méthodes de culture 3D, y compris la bio-impression, exigent que les cellules soient intégrées dans une matrice 3D, ce qui rend difficile l’extraction et l’analyse des cellules pour détecter les changements dans la viabilité et l’expression des biomarqueurs sans provoquer de dommages mécaniques. Ce protocole décrit comme preuve de concept, une méthode pour évaluer la biocompatibilité d’un composite d’agarose incorporé dans la nanocellulose cristalline (CNC), fabriqué dans un système de culture à 24 puits, avec des mastocytes dérivés de la moelle osseuse de souris (BMMC) à l’aide de tests cytométriques en flux pour la viabilité cellulaire et l’expression de biomarqueurs.
Après 18 h d’exposition à la matrice CNC/agarose/D-mannitol, la viabilité du BMMC n’a pas été modifiée par la perméabilité à l’iodure de propidium (PI). Cependant, les BMMC cultivés sur le substrat CNC/agarose/D-mannitol semblaient augmenter légèrement leur expression du récepteur IgE à haute affinité (FcεRI) et du récepteur du facteur des cellules souches (Kit; CD117), bien que cela ne semble pas dépendre de la quantité de CNC dans le composite bioencre. La viabilité des BMMC a également été évaluée à la suite d’une exposition prolongée à des échafaudages d’hydrogel fabriqués à partir d’une encre de biomatériau commercial composée de nanocellulose fibrillaire (FNC) et d’alginate de sodium à l’aide d’une bioimprimante d’extrusion 3D. Sur une période de 6 à 48 h, les substrats FNC/alginate n’ont pas nui à la viabilité des BMMC telle que déterminée par cytométrie en flux et essais de microtitre (XTT et lactate déshydrogénase). Ce protocole décrit une méthode efficace pour filtrer rapidement la compatibilité biochimique des encres de biomatériaux candidats pour leur utilité en tant qu’échafaudages 3D pour l’ensemencement post-impression avec des mastocytes.
Introduction
L’intérêt récent pour les systèmes de culture 3D et la bio-impression 3D a attiré l’attention sur les hydrogels et les composites d’hydrogel. Ces composites servent de biomimétiques visqueux mais poreux et peuvent être composés jusqu’à 99% d’eau en poids, ce qui est comparable aux tissus biologiques1,2,3. Ces caractéristiques des composites d’hydrogel permettent ainsi la croissance des cellules sans affecter leur viabilité et leur fonction. L’un de ces composites est la nanocellulose cristalline (CNC), qui a été utilisée comme matériau de renforcement dans les composites d’hydrogel, les échafaudages cellulaires dans le développement d’implants de biomatériaux et dans la culture cellulaire in vitro bidimensionnelle (2D) et 3D4,5. Pour la plupart, les matrices composées de CNC ne sont pas ouvertement cytotoxiques pour les cellules épithéliales cornéennes humaines6, les cellules épithéliales intestinales7, les cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine8 ou les cellules de type neurone9. Cependant, l’activité métabolique et la prolifération des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse humaine diminuent en corrélation avec l’augmentation de la viscosité des composites de nanocellulose à base de bois, ce qui suggère que la composition de la matrice doit être soigneusement testée pour ses effets délétères sur les fonctions cellulaires8.
De même, la CNC peut induire des réponses inflammatoires dans les macrophages lors de l’internalisation, ce qui pourrait avoir de graves conséquences dans les systèmes de culture de cellules immunitaires 3D10,11. En fait, il y a très peu de données disponibles sur la façon dont la CNC peut influencer d’autres réponses des cellules immunitaires, en particulier les réponses inflammatoires allergiques qui sont initiées par les mastocytes. Les mastocytes sont des leucocytes granulés qui expriment le récepteur IgE à haute affinité, FceRI, responsable de l’activation des réponses inflammatoires aux allergènes. Leur prolifération et leur différenciation dépendent du facteur de cellules souches (SCF), qui lie le récepteur de la tyrosine, Kit. Les mastocytes sont dérivés de cellules progénitrices de la moelle osseuse qui pénètrent dans la circulation et migrent ensuite périphériquement pour se disperser de manière omniprésente dans tous les tissus humains12. Comme les mastocytes fonctionnent dans un environnement tissulaire 3D, ils sont un candidat idéal pour les cellules immunitaires pour étudier les processus immunologiques dans des modèles tissulaires 3D in vitro. Cependant, à ce jour, il n’existe aucun modèle de tissu 3D in vitro viable contenant des mastocytes.
En raison de la nature très sensible des mastocytes et de leur propension à provoquer des réponses pro-inflammatoires aux stimuli externes, un examen attentif des constituants de la matrice 3D et de la méthode de bio-impression pour introduire des mastocytes dans l’échafaudage 3D est nécessaire, comme nous l’avons vu plus loin. Les constructions tissulaires peuvent être biofabriquées à partir de deux grandes catégories de biomatériaux, à savoir les bioencres et les encres de biomatériaux. La distinction réside dans le fait que les bioencres sont des composites d’hydrogel chargés de cellules, tandis que les encres de biomatériaux sont des composites d’hydrogel dépourvus de cellules, tels que définis par Groll et al.13,14. Par conséquent, les constructions 3D imprimées avec des bioencres contiennent des cellules pré-intégrées dans la matrice d’hydrogel, tandis que les constructions 3D imprimées avec des encres de biomatériaux doivent être ensemencées avec des cellules après l’impression. La biofabrication d’échafaudages de culture à partir d’encres bioencreuses / biomatériaux à base d’hydrogel est le plus souvent effectuée à l’aide de bioimprimantes 3D d’extrusion, qui extrudent l’encre bioencre / biomatériau à travers une buse à micro-échelle sous pression via un piston à entraînement pneumatique ou mécanique14. Les bioimprimantes par extrusion fabriquent des échafaudages 3D en déposant la bioencre dans des motifs de coupe transversale 2D qui sont empilés séquentiellement les uns sur les autres dans une approche « ascendante ».
Pour être compatible avec la bioimpression par extrusion, l’encre bioencre/biomatériau à base d’hydrogel doit posséder des propriétés thixotropes (amincissement par cisaillement), par lesquelles les polymères hydrogel constitutifs de l’encre bioencre/biomatériau s’écoulent comme un fluide à travers une buse à microcanaux lorsqu’ils sont soumis à une contrainte de cisaillement, mais reviennent à un état visqueux semblable à celui d’un gel lors de l’élimination de la contrainte de cisaillement15 . En raison de leur teneur élevée en eau, les polymères des encres bioencres/biomatériaux à base d’hydrogel doivent être réticulés, physiquement ou covalentement, pour maintenir l’architecture et l’intégrité structurelle de la structure bioimprimée en 3D. Dans le cas des bioencres chargées de cellules, les cellules sont directement soumises à des contraintes chimiques pendant le processus de réticulation. Le processus d’extrusion des cellules encapsulées dans la matrice d’hydrogel bioencre soumet également les cellules à un stress de cisaillement, ce qui peut entraîner une viabilité réduite et / ou la mort cellulaire. Une fois que le modèle tissulaire 3D a été bioimprimé, il est difficile de faire la distinction entre les niveaux de cytotoxicité provoqués par la matrice d’hydrogel elle-même et les processus d’extrusion et de réticulation, respectivement. Ceci est particulièrement difficile dans le contexte des échafaudages 3D où les cellules sont pré-intégrées dans la matrice d’hydrogel, ce qui rend difficile l’élimination des cellules pour des analyses ultérieures, ce qui serait préjudiciable à la viabilité des mastocytes.
Une approche plus douce pour générer des constructions tissulaires 3D contenant des mastocytes consiste à ensemencer les cellules dans des échafaudages 3D d’encre de biomatériau poreux pré-imprimés à partir d’une suspension de culture cellulaire, ce qui tire parti de la capacité innée des mastocytes à migrer de la circulation vers les tissus périphériques. Les avantages de cette approche d’ensemencement cellulaire sont doubles: (i) les mastocytes ne sont pas soumis au cisaillement et aux contraintes chimiques des processus d’extrusion et de réticulation, respectivement, et (ii) les cellules peuvent être facilement retirées de l’échafaudage 3D après exposition par lavage doux pour analyse sans nuire à leur viabilité. L’avantage supplémentaire de l’ensemencement et de l’analyse de la viabilité cellulaire des mastocytes sur des échafaudages d’hydrogel poreux bioimprimés en 3D par opposition aux disques d’hydrogel 2D est que les échafaudages d’hydrogel bioimprimés en 3D récapitulent les caractéristiques topographiques micro-échelles des tissus in vivo , qui ne sont pas présents dans les disques d’hydrogel planaires 2D en vrac. Cette approche est une approche appropriée, rapide et rentable pour déterminer les effets cytotoxiques potentiellement catastrophiques des matrices d’hydrogel de bioencre candidates sur les mastocytes, ainsi que sur d’autres cellules immunologiques, avant d’investir dans des expériences coûteuses d’ingénierie tissulaire 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fabrication de tissus biomimétiques 3D nécessite l’amalgame réussi de la bioencre, qui imite les composants de la matrice extracellulaire, avec le ou les composants cellulaires pour créer des analogues physiologiques de tissus in vivo . Cela nécessite l’utilisation de cellules primaires, et non de cellules transformées, lors de la fabrication de tissus biomimétiques physiologiques. Les cellules immunologiques primaires, telles que les mastocytes, sont cependant particulièrement sensibles aux effet…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Alberta Innovates d’avoir fourni le CNC et Ken Harris et Jae-Young Cho pour leurs conseils techniques lors de la préparation de la matrice CNC/agarose/D-mannitol. Nous remercions également Ben Hoffman, Heather Winchell et Nicole Diamantides pour leurs conseils techniques et leur soutien dans la configuration et l’étalonnage de la bioimprimante 3D INKREDIBLE+.
Materials
| A | |||
| Acetic Acid (glacial) | Sigma Aldrich | AX0074-6 | |
| Agarose (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2125-500GM | |
| Armenian Hamster IgG Isotype Control, APC (Clone: eBio299Arm) | Thermo Fisher Scientific | 17-4888-82 | |
| B | |||
| b-Mercaptoethanol | Fisher Scientific | O3446I-100 | |
| b-Nicotinamide adenine dinucleotide sodium salt (NAD) | Sigma Aldrich | N0632-5G | |
| BD 5 mL Syringe (Luer-Lok Tip) | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Needle 26G x 1/2 in | BD | 305111 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 930-186 | |
| BioLite 96 Well Multidish | Thermo Fisher Scientific | 130-188 | |
| BioLite 175 cm2 Flask Vented | Thermo Fisher Scientific | 130-191 | |
| Biosafety Cabinet Class II | Microzone Corp., Canada | BK-2-6-B3 | |
| BSA, Fraction V (OmniPur) | EMD Millipore Corporation | 2930-100GM | |
| C | |||
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CD117 (c-Kit) Monoclonal Antibody, PE (Clone: 2B8) | Thermo Fisher Scientific | 12-1171-82 | |
| CELLINK BIOINK (3 x 3 mL Cartridge) | CELLINK LLC | IK1020000303 | |
| CELLINK CaCl2 Crosslinking Agent – Sterile Bottle 1 x 60 mL | CELLINK LLC | CL1010006001 | |
| CELLINK Empty Cartridges 3cc with End and Tip Caps | CELLINK LLC | CSC0103000102 | |
| CELLINK HeartWare for PC | CELLINK LLC | Version 2.4.1 | |
| CELLINK INKREDIBLE+ 3D BIOPRINTER | CELLINK LLC | S-10003-001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 22G | CELLINK LLC | NZ4220005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 25G | CELLINK LLC | NZ4250005001 | |
| CELLINK Sterile Standard Conical Bioprinting Nozzles 27G | CELLINK LLC | NZ4270005001 | |
| Cell Proliferation Kit II (XTT) (Roche) | Sigma Aldrich | 11465015001 | |
| Centrifuge (Benchtop) | Eppendorf | 5804R | |
| Corning Costar 96 Well Clear Flat-Bottom Non-Treated PS Microplate | Sigma Aldrich | CLS3370 | |
| CO2 Incubator | Binder GmbH, Germany | 9040-0113 | |
| CytoFLEX Flow Cytometer | Beckman Coulter | A00-1-1102 | |
| D | |||
| D-mannitol (MilliporeSigma Calbiochem) | Fisher Scientific | 44-390-7100GM | |
| F | |||
| Falcon 15 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352095 | |
| Falcon 50 mL Polystyrene Conical Tubes, Sterile | Corning | 352070 | |
| FceR1 alpha Monoclonal Antibody, APC (Clone: MAR-1) | Thermo Fisher Scientific | 17-5898-82 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, heat inactivated | Thermo Fisher Scientific | 12484028 | |
| FlowJo Software | Becton Dickinson & Co. USA | Version 10.6.2 | |
| G | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 8.4.3 | |
| H | |||
| Hemacytometer (Improved Neubauer 0.1 mmm deep levy) | VWR | 15170-208 | |
| HEPES Sodium Salt | Fisher Scientific | BP410-500 | |
| I | |||
| Iodonitrotetrazolium chloride (INT) | Sigma Aldrich | I10406-5G | |
| L | |||
| L-Glutamine 200 mM (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Lithium L-lactate | Sigma Aldrich | L2250-100G | |
| M | |||
| MEM Non-Essential Amino Acids 100 mL 100x (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| 1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate (MPMS) | Sigma Aldrich | M8640 | |
| Microtubes (1.7 mL clear) | Axygen | MCT-175-C | |
| Microtubes (2.0 mL clear) | Axygen | MCT-200-C | |
| MilliQ Academic (for producing MilliQ ultrapure water) | Millipore | ZMQS60001 | |
| N | |||
| Nalgene Rapid-Flow 90 mm Filter Unit (0.2 mm Pore size, 500 mL) | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | |
| Nalgene Syringe filter (0.2 mm PES, 25 mm) | Thermo Fisher Scientific | 725-2520 | |
| P | |||
| Penicillin Streptomycin 100 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PBS pH 7.4, No Calcium/Magnesium, 500 mL (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Propidium iodide, 1.0 mg/mL (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | P3566 | |
| R | |||
| Rat IgG2b kappa Isotype Control, PE (Clone: eB149/10H5) | Thermo Fisher Scientific | 12-4031-82 | |
| Recombinant Murine IL-3 | PeproTech, Inc. | 213-13 | |
| RPMI-1640 Medium 1X + 2.05 mM L-Glutamine (HyClone) | GE Healthcare | SH30027.01 | |
| S | |||
| Sarstedt 96 well round base PS transparent micro test plate (82.1582.001) | Fisher Scientific | NC9913213 | |
| Sodium Azide, 500 g | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) 100X (Gibco) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| T | |||
| Tris Base (2-amino-2(hydroxymethyl)-1,3-propanediol) | Sigma Aldrich | 252859 | |
| Trypan Blue solution (0.4%, for microscopy) | Sigma Aldrich | 93595 | |
| V | |||
| VARIOSKAN LUX Microplate Spectrophotometer (Type: 3020) | Thermo Fisher Scientific | VLBL00D0 |
References
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