انسداد الجراحة المجهرية لاندماج الخصيتين في Spodoptera litura
Summary
تم إدخال رقائق الألومنيوم جراحيا بين خصيتي Spodoptera litura لعرقلة اندماج الخصية. يتضمن الإجراء التجميد والتثبيت والتطهير والشق ووضع الحاجز والخياطة والتغذية بعد العملية الجراحية والتفتيش. يوفر هذا النهج طريقة للتداخل مع تكوين الأنسجة.
Abstract
بدلا من استخدام الطرق الجينية مثل تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) وتكرار الباليندروميك القصير المتجمع بانتظام (CRISPR) / endonuclease Cas9 المرتبط بكريسبر ، تم إدخال حاجز مادي جراحيا مجهريا بين خصيتي Spodoptera litura لدراسة تأثير هذه الجراحة المجهرية على نموها وتكاثرها. بعد إدخال رقائق الألومنيوم بين الخصيتين ، استمر طرح الحشرات أثناء التحول بشكل طبيعي. لم يتغير نمو الحشرات وتطورها بشكل ملحوظ. ومع ذلك ، تغير عدد حزم الحيوانات المنوية إذا تم إيقاف اندماج الخصيتين عن طريق الجراحة المجهرية. تشير هذه النتائج إلى أن منع اندماج الخصية يمكن أن يؤثر على قدرة الذكور على الإنجاب. يمكن تطبيق هذه الطريقة بشكل أكبر لمقاطعة الاتصال بين الأعضاء لدراسة وظيفة مسارات إشارات محددة. بالمقارنة مع الجراحة التقليدية ، تتطلب الجراحة المجهرية فقط تخديرا مجمدا ، وهو أفضل من تخدير ثاني أكسيد الكربون. تقلل الجراحة المجهرية أيضا من منطقة موقع الجراحة وتسهل التئام الجروح. ومع ذلك ، فإن اختيار المواد ذات الوظائف المحددة يحتاج إلى مزيد من التحقيق. تجنب إصابة الأنسجة أمر بالغ الأهمية عند إجراء شقوق أثناء العملية.
Introduction
الانصهار هو ظاهرة شائعة في تطور الأنسجة أو الأعضاء. ومن الأمثلة على ذلك الإغلاق الظهري وإغلاق الصدر في ذبابة الفاكهة 1 ومورفوجينيا الحنك ، ومورفوجينيا الأنبوب العصبي ، ومورفوجينيا القلب في الفئران والدجاج 2. تم تطبيق كريسبر والحمض النووي الريبي للتحقيق في أدوار الجينات في عملية الانصهار2،3،4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) هي آفة متعددة البلعوم ضارة تنتشر على نطاق واسع في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية في آسيا ، بما في ذلك China4,5,6. ويعزى التوزيع الواسع النطاق للبكتيريا S. litura جزئيا إلى قدرتها الإنجابية القوية ، والتي لها صلة بتطور الغدد التناسلية. العقم عند الذكور هو أحد الأساليب للسيطرة على هذه الآفة. كما هو موضح في الشكل التخطيطي لبنية الخصية ، يتم إحاطة الخصيتين بغمد الخصية ، بما في ذلك الغمد الخارجي (الغمد البريتوني) والصفيحة القاعدية الداخلية. تمتد الصفيحة القاعدية داخليا لتشكيل الظهارة الجريبية وتفصل المنطقة الداخلية من الخصية إلى أربع غرف تسمى البصيلات (الشكل 1).
في البصيلات، تتطور الحيوانات المنوية إلى منوية بعد الانقسام والانقسام الاختزالي، ثم تصطف الحيوانات المنوية في أكياس الحيوانات المنوية في نفس الاتجاه لتشكيل حزم الحيوانات المنوية7. أثناء تكوين الحيوانات المنوية ، تتمايز الخلايا المنوية الأولية إلى منوية من اليوبيرين أو الحيوانات المنوية من الأبيرين. تتطور الخلايا المنوية في مرحلة اليرقات إلى منوية من اليوبيرين مع ذيل طويل متصل برأس نواة ممدودة ؛ هذه يمكن أن تخصب البيض. على العكس من ذلك ، تتطور الخلايا المنوية في مرحلة منتصف العذراء إلى منوية من الأبيرين مع نواة مهملة. تساعد هذه الحيوانات المنوية على بقاء الحيوانات المنوية وحركتها وإخصابها 9,10. اليوم 6 من الخادرة هو الفترة التي تحتوي خلالها الخصيتان على حزم وفيرة من الحيوانات المنوية من اليوبيرين والأبيرين.
الشكل 1: مخطط تخطيطي لبنية الخصية لحشرات Lepidoptera11. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
يحدث اندماج الخصية في معظم الحشرات من ترتيب Lepidoptera11,12 ، وخاصة في تلك الأنواع التي هي الآفات الزراعية. يشير اندماج الخصية إلى زوج من الخصيتين ينمو بشكل ثنائي في مرحلة اليرقات ، ويقترب ويلتصق ببعضهما البعض ، ويندمج في النهاية في غدد غدد غصني واحد11. في Spodoptera litura، يحدث ذلك أثناء التحول من اليرقات إلى مرحلة العذراء. من اليوم 1 من النجم الخامس (L5D1) إلى اليوم 4 من النجم السادس (L6D4) ، ينمو زوج الخصيتين تدريجيا في الحجم ، ويتحول اللون إلى اللون الأصفر الفاتح من الأبيض العاجي. يصبح أحمر باهت عندما يصل إلى المرحلة القبلية (L6D5 إلى L6D6). تقترب خصيتان متماثلتان ثنائيتان من بعضهما البعض خلال مرحلة ما قبل العذراء، وتندمجان في واحدة، وتلتوي عكس اتجاه عقارب الساعة (الرؤية الدوارة) لإنتاج خصية واحدة في مرحلتي العذراء والبالغين11. لا تحدث هذه الظاهرة في ديدان القز ، التي لها أهمية اقتصادية كبيرة وتم تدجينها لمدة 5000 عام13. وبالتالي ، من المفترض أن اندماج الخصيتين يحسن القدرة الإنجابية.
لتحديد أهمية اندماج الخصية Spodoptera litura ، من المهم التحقيق في آثار منع العملية. في هذا البروتوكول ، تم إدخال رقائق الألومنيوم بشكل مجهري بين الخصيتين لإبقائهما منفصلين ، وتمت دراسة التغيرات الناتجة في تطور الحشرات والخصيتين.
Protocol
Representative Results
Discussion
بعد إعاقة اندماج الخصيتين جراحيا في Spodoptera litura، انخفض عدد حزم الحيوانات المنوية، مما دعم الفرضية القائلة بأن هذا الاندماج مفيد للقدرة الإنجابية. وقد استخدم التلاعب الجراحي لدراسة التطور الفسيولوجي للحشرات منذ أوائل القرن 20th. لتحديد ما إذا كان العصب القحفي ينظمه تحول الحشرات ، ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (Nos.:31772519, 31720103916; ) ومنحة مفتوحة من مختبر مفتاح الدولة لبيولوجيا جينوم دودة القز، جامعة ساوث ويست (رقم: sklsgb2013003).
Materials
| 75% Rubbing alcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Colored Push Pins | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Corneal Scissors | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Curved and blunt tip |
| Glad Aluminum Foil | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2.5 cm*0.6 |
| Medical Cotton Swabs (Sterile) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medical Iodine Cotton Swab | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Needle holder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fine needle |
| Sterile surgical blade | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Suigical Blade Holder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Straight 3# |
| Suture thread with needle | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | needle: 3/8 Circle, 2.5*8 ; Thread: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Tying Forceps | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Straight-pointed; long handle; 0.12 mm-wide-head |
References
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206 (2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486 (1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. . Physiological systems in insects. , (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102 (2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and ‘metamorphosis’ in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134 (1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618 (2016).
